高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立.pdf

高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立汤瑞玲范立青(.湖北科技学院医学部基础医学院人体解剖教研室湖北 咸宁.中南大学湘雅医学院基础医学院生殖与干细胞工程研究所)摘要:目的 建立高龄小鼠精原干细胞()体外长期培养体系 方法 将 只 月龄昆明白小鼠用于本实验组织形态学技术评估睾丸生精状态优化睾丸体细胞去除流程、原代和传代中饲养层与生长因子组合条件观察小鼠 克隆形成、增殖与传代细胞生物学与分子生物学技术检测小鼠 克隆的干细胞特征 结果 高龄小鼠睾丸精曲小管存在生精损害精原细胞数量增加优化实验条件后富集的精原细胞数量增加体外成功培养传代高龄小鼠 克隆 个月高龄小鼠 克隆具有 活性并表达、等精原干细胞标记物 结论 本研究通过优化消化、富集、原代和传代培养的多个环节成功建立高龄小鼠 体外长期培养体系关键词:高龄小鼠精原干细胞体外长期培养 中图分类号:文献标识码:文章编号:()开放科学(资源服务)标识码():./.():.:湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()基金项目:年市科协科技创新智库课题()通讯作者:.随着全球进入后工业化时代生育年龄推后以及二胎政策的施行高龄父亲()的生殖状态及其对子代健康的影响已经成为全球研究热点 临床人群研究显示高龄父亲子代发生先天畸形、儿童肿瘤、智力低下、精神疾病如孤独症和精神分裂症以及不良孕产史的风险大大增加 高龄雄性睾丸中精原干细胞()发生的新发基因突变和表观遗传异常均可通过精子传递从而导致严重的子代健康问题称为父亲年龄效应()父亲年龄超过 岁导致 疾病风险呈指数级增加小鼠睾丸细胞转录组学显示 月龄 即开始表达衰老相关基因 目前 衰老研究集中于新生期和性成熟期小鼠来源的 体外长期培养造成的遗传和表观遗传改变直接来源于高龄小鼠睾丸 体外培养体系尚未见报道 本研究拟建立 月龄小鼠睾丸来源 体外培养体系可以完整保存 发生衰老改变时的遗传、表观遗传、基因表达特征将为阐明高龄 衰老启动时的遗传和表观遗传调控机制提供有力的研究工具 材料与方法.动物 周龄成年雄性昆明白小鼠购自湖南史莱克景达有限责任公司饲养于中南大学生殖与干细胞工程中心实验动物房用于实验室正常小鼠繁殖配种 光照 黑暗水食自由所有实验动物处理均遵循实验动物管理和使用指南 只 月龄小鼠停止配种后继续饲养至 月龄用于本实验.试剂和仪器 培养基、高糖、维生素、丙酮酸钠、购 自 美 国 公 司 购自美国 公司、购自 公司、和 均购于美国 公司腐胺、()葡萄糖、乳酸、维生素、生物素、巯基乙醇购自 公司 胶原酶、中性蛋白酶和.胰酶/购自美国 公司透明质酸酶和 酶购自美国 公司.明胶购自美国 公司/碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自美国 公司兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体、鼠抗 单克隆抗体均购自美国 公司兔抗 购自 公司驴血清、标记驴抗兔二抗、标记驴抗小鼠二抗购自美国 公司 免疫组化试剂盒购自中国福建迈新公司 购自美国 公司 逆转录试剂盒购自美国 公司 购自日本 公司江丰数字切片扫描仪购自中国江丰公司体视光学显微镜购自德国蔡司公司倒置相差荧光显微镜购自日本尼康公司水套式二氧化碳培养箱购自美国 公司.实验方法.高龄小鼠睾丸切片 染色和 检测 表达 周龄和 月龄昆明白小鼠脱颈致死睾丸用 固定液固定梯度酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋切片切片厚度 免疫组化()染 色:常 规 脱 蜡 至 水/甘氨酸脱甲醛 过氧化氢消除内源性生物素正常羊血清封闭 稀释兔抗 抗体孵育过夜生物素标记羊抗兔二抗室温孵育链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育 显色苏木素复染中性树脂封片 苏木素伊红()染色:常规脱蜡至水苏木素染色.盐酸酒精分色自来水返蓝 醇溶伊红染色 中性树脂封片 和 切片使用江丰数字切片扫描仪扫描 阅片软件截屏拍照.三步酶消化法消化高龄小鼠睾丸获取单细胞悬液()配制消化酶 消化酶:高糖 加入/胶原酶、/透明质酸酶消化酶:高糖 加入/胶原酶、/透明质酸酶、/中性蛋白酶、/酶消化酶:.胰酶/加入/酶.无菌过滤器 保存过滤备用()三步酶消化 脱颈处死 月龄雄性昆明白小鼠 只取出双侧睾丸去除睾丸白膜在体式显微镜下用钟表镊分离精曲小管之间的间质组织和血管 洗涤 次将松散完整精曲湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()小管移到 离心管中加入 消化酶进行第一步消化:水浴 次/震荡消化 加入 高糖 和 终止消化静置沉降 共 次吸弃上清中的间质组织和细胞直至洗涤液清亮 吸管轻轻吹吸精曲小管 次 离心 收集上清单细胞悬液管底沉淀的精曲小管片段加入 消化酶进行第二步消化:水浴 次/震荡消化 加入 终止反应 吸管轻轻吹吸 次帮助精曲小管和细胞团块解离 离心 收集上清单细胞悬液 不含钙镁的 洗涤管底的精曲小管残迹和细胞团块 离心 管底沉淀的细胞团块加入 消化酶进行第三步消化:水浴 次/震荡消化 加入 终止消化 吸管轻轻吹吸 次直至细胞团块完全解离将第一、二、三步消化中收集的全部细胞悬液用 目无菌筛网过滤 离心 高糖 和 洗涤含 的精原干细胞培养液重悬细胞计数.个细胞台盼蓝染色检测细胞活性达以上 将细胞按 /的密度接种到.明胶预包被的 个 皿中 差异贴壁培养.高龄小鼠精原干细胞原代培养()配制小鼠精原干细胞培养液 加入 专用补充物作为基础培养基逐次加入 维生素、丙酮酸钠、/腐胺、/()葡萄糖、/乳酸、/维生素、/生物素、/、/、/巯基乙醇根据需要的浓度最后加入胎牛血清().无菌过滤器过滤 保存备用()小鼠来源胚胎成纤维细胞饲养层和条件培养基制备 小鼠胚胎成纤维细胞()培养液由高糖 添加 组成液氮罐取出冻存的 代 小鼠来源 解冻后加入 培养液 接种到.明胶预包被的 大皿常规换液培养 以 比例传代 代换液常规培养 至细胞铺满皿底 洗涤 次加入配有/丝裂霉素 的 培养液、培养.洗涤、消化、离心收集丝裂霉素 处理的 代 按 /管加入冻存液放入液氮中冻存冻存液由 和 组成 制备条件培养基时按./.接种密度铺入 孔板中的 孔加入 精原干细胞培养液每隔 收集条件培养基并更换新鲜精原干细胞培养液 后观察饲养层细胞状态如果不佳即丢弃()高龄小鼠精原干细胞原代培养 差异贴壁培养 后倒置显微镜下见 个 中皿贴壁体细胞约占皿底/生殖细胞悬浮在培养液中少量细胞相互积聚形成细胞团块收集上清生殖细胞细胞计数.以.接入铺有密度为./.饲养层的 孔板中 孔加入 含 的精原干细胞培养液 培养翌日观察到绝大部分生殖细胞已贴壁仅少许悬浮细胞隔日换液每个培养孔加入 条件培养液和新鲜精原干细胞培养液各 记为 代()高龄小鼠精原干细胞的传代培养 代细胞培养 后倒置显微镜下见 孔板 个孔的生殖细胞大量死亡漂在培养液中 饲养层上剩余的精原细胞堆积成大量小细胞团块 每孔加入/中性蛋白酶 /胶原酶消化 轻轻吹吸皿底至饲养层上的生殖细胞团块完全脱落皿底仅剩余部分饲养层细胞等体积含有 的 终止反应 离心 按 传代接入铺有密度为/.饲养层的 孔板中 孔继续培养记为 代第 观察到精原细胞呈葡萄串状聚集可见多个包含 个细胞的精原干细胞克隆形成/中性蛋白酶/胶原酶消化传代传代比例 从 到 代高龄小鼠 克隆增殖比较缓慢传代间隔为 传代比例为 或 在此期间保持精原干细胞培养液中 的浓度、来源 饲养层铺皿密度 /.如果出现细胞 不增殖时可加入新鲜解冻的 增加饲养层密度或者加入 条件培养基以促进高龄小鼠 克隆增殖 代以后高龄小鼠 克隆体外增殖处于稳定状态传代间隔缩短至 传代比例为 代开始将精原干细胞培养液中 以每周下降 的梯度逐渐调整至 周后再调整至饲养层接种密度调整至./.体外稳定传代培养 个月共传 代在传代和实验需要之外将 孔板中湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()每孔细胞加入由 和 配制的冻存液放入 个冻存管置入液氮中保存.高龄小鼠精原干细胞克隆的干性、精原干细胞标记物检测()染色检测 克隆的碱性磷酸酶活性 代 接种到 个孔内常规培养 第 进行 克隆的 染色:吸弃培养液洗涤 次 多聚甲醛 室温固定 双蒸水 洗 次每次 按照使用说明书配制/染色液加 染色液入培养孔室温孵育 吸弃染色液用双蒸水洗 次各 倒置显微镜观察 克隆颜色变化如果呈浅蓝色可继续加入染色液再染 双蒸水洗涤 次 克隆细胞呈深蓝色时拍照()免疫荧光检测 克隆的精原细胞标记物的蛋白表达情况 代 接种到 个孔内常规培养 第 进行 克隆的免疫荧光染色吸弃培养孔内的培养液 洗涤 次 多聚甲醛 室温固定 洗 次各正常驴血清 室温封闭 吸弃驴血清分别加 一抗:和 兔抗多克隆抗体、鼠抗单克隆抗体用 驴血清按 浓度稀释、兔抗多克隆抗体用含有.的 驴血清按 浓度稀释阴性对照孔留置封闭液 冰箱孵育过夜 洗 次各 加入 稀释的 标记驴抗兔二抗 室温避光孵育 洗 次各 浓度 复染细胞核 洗涤 次 倒置荧光显微镜观察 克隆荧光染色结果并拍照()检测 克隆的精原干细胞标记物 表达情况 孔板培养孔用 预冷 洗涤 次 裂解液轻轻吹吸移入.无核酶污染 管内冰上裂解 加.氯仿按照 使用说明书抽提 溶于 水测/计算 浓度和纯度 冻存取 总 按照逆转录试剂盒说明书冰上配制 反应体系获得 反应程序为:孵育 孵育 取 为模板配制 反应体系程序如下:预变性(变性 退火 延伸)循环终延伸 基因引物序列见表 产物用.琼脂糖胶 电泳 分离 凝胶成像系统拍照表 检测 表达的引物序列 结 果.高龄小鼠睾丸内精曲小管出现形态学改变 月龄高龄小鼠睾丸大体形态与 周龄正常小鼠相似(图)染色观察到 月龄高龄小鼠睾丸出现精子异常的精曲小管:部分精曲小管内出现各级生精细胞排列紊乱偶见精曲小管仅保留 细胞和精原细胞而其他生精细胞均缺失(图)进行 检测显示 周龄正常对照小鼠 表达于 型未分化精原细胞()表达于 型分化精原细胞()不表达于中间型分化精原细胞()(图)月龄高龄小鼠生精正常和生精异常精曲小管中均存在 和 精原细胞同时 还表达于 分化精原细胞(图)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()红色三角:周龄整体睾丸蓝色三角:月龄整体睾丸红色箭头:仅剩余基底膜侧生精细胞的精曲小管蓝色箭头:生精细胞排列紊乱的精曲小管红色无尾箭头:精原细胞蓝色无尾箭头:细胞红色星号:型未分化精原细胞蓝色星号:型分化精原细胞紫色星号:中间型 分化精原细胞图 高龄小鼠的大体形态、染色和 检测().高龄小鼠单个整体睾丸经过间质预处理和三步酶消化解离成单细胞悬液高龄小鼠难以成批获取我们只能进行单只高龄小鼠原代培养为尽可能多的获取精原干细胞我们需要优化消化过程 在去除白膜后消化前先用钟表镊机械分离小鼠睾丸间质中的血管和结缔组织减少第一步消化时间同时尽可能多的去除间质组织和成纤维细胞 分离液中充满离散的间质组织团块未完全分离的血管残端仍然附着在精曲小管上(图)充分洗涤预处理的睾丸组织上清液中可见大量的间质细胞和间质组织团块(图)第一步胶原酶和透明质酸酶消化后可见大量间质组织从精曲小管壁完全脱落(图)再次充分洗涤丢弃间质组织和细胞之后洗涤液中可见完整脱落的间质血管(图)洗涤后保留的精曲小管管壁光滑悬浮液中残存极少量间质细胞(图)将洗涤后收集的精曲小管反复吹吸之后大量精曲小管断裂崩解(图)第二步胶原酶、透明质酸酶和中性蛋白酶组合消化和吸管反复吹吸后精曲小管完全解体仅剩余少量未消化的细胞团块(图)第三步胰酶消化和吸管反复吹吸后精曲小管基本完全解离尚有极少量的小细胞团块(图)目筛网过滤掉细胞团块至此高龄小鼠睾丸组织完全解离成单细胞悬液(图)红色箭头:精曲小管蓝色箭头:间质血管紫色箭头:间质组织黑色箭头:细胞团块图 高龄小鼠消化前预处理精曲小管形态改变过程().高龄小鼠的 差异贴壁富集和原代培养将消化解离的高龄小鼠睾丸单细胞悬液接种到.明胶包被的 个 中皿每隔 观察贴壁的体细胞密度 后贴附在皿底的体细胞约占皿底面积的/(图)收集悬浮的生殖细胞并洗涤培养皿可见皿底稀疏的贴壁体细胞(图)将丝裂霉素 处理的 细胞按./密度铺皿作为高龄小鼠精原干细胞培养的饲养层细胞(图)将收集的生殖细胞以 /密度接种到饲养层上进行原代培养记为 代(图)可见生殖细胞集聚成葡萄串状贴附在 饲养层上面其中有少量有丝分裂旺盛的 来源子细胞紧密结合形成直径 小克隆(图)可见葡萄串状的生殖细胞团块数量减少进入有丝分裂增殖的 数量增加直径增大最大直径约(图)日 克隆数量和克隆直径进一步增加最大 克隆直径约仅剩余极少量未进入增殖状态的原代生殖细胞这些原代生殖细胞核直径仍保持在 左右(图)日可见 克隆数量和克隆直径继续增加最大 克隆直径约未观察到原代生殖细胞(图)可见 克隆处于稳定增殖状态细胞状态良好(图)代开始逐渐降低精原干细胞培养液中血清浓度和 饲养层铺皿密度(图)(图)和(图)传代过程中随着残留的老化 凋亡培养皿中 密度逐渐降低 克隆仍处于稳定增殖状态克隆细胞状态良好湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()红色箭头:葡萄串状生殖细胞团块蓝色箭头:克隆绿色箭头:未进入增殖状态的原代生殖细胞图 高龄小鼠睾丸消化细胞中 差异贴壁富集、原代培养 克隆形成和传代培养().体外培养高龄小鼠 克隆具有碱性磷酸酶活性表达精原干细胞标记物免疫荧光检测显示高龄小鼠 克隆表达、种未分化精原细胞标记蛋白(图)不表达 分化精原细胞蛋白(图)和 精母细胞蛋白(图)染色显示高龄小鼠 克隆表达碱性磷酸酶(图)结果显示高龄小鼠 克隆表达未分化精原细胞标记物、也表达分化精原细胞标记物 和精母细胞标记物 (图):免疫荧光第一列代表 克隆抗体荧光染色第二列代表 克隆 复染第三列代表 克隆明场形态代表阴性对照:染色:代表阴性对照图 免疫荧光、染色和 检测高龄小鼠 克隆的干细胞活性和精原干细胞标记物在蛋白和 水平的表达情况()讨 论.高龄小鼠睾丸微环境更有利于 型精原细胞增殖与存活在正常睾丸发育过程中 高表达于 而弱表达于 本研究 显示在高龄小鼠睾丸中 除了 与 精原细胞之外还表达于 分化精原细胞提示高龄小鼠睾丸微环境可能促进 分化精原细胞的去分化以及 的 和 精原细胞存活和增殖与文献报道结果一致 文献研究结果表明高龄小鼠睾丸微环境发生氧化应激改变导致活性氧()水平升湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()高 激活 基因表达促进精原细胞增殖而使精曲小管内其余生精细胞凋亡.通过优化睾丸消化分离富集步骤最大程度获取单只高龄小鼠睾丸来源精曲小管和有活力的单细胞 月龄高龄小鼠成批获取较困难本课题组选择每次进行单只高龄小鼠的睾丸细胞消化富集和原代培养 根据前期经验第一步消化时剪碎的精曲小管片段和消化下来的间质细胞团块比重相似造成静置沉降时精曲小管片段与间质细胞团块都沉降在管底导致消化的单细胞中存在间质成纤维细胞污染需要经历多轮差异贴壁甚至多次传代才能够去除 在本研究中我们通过消化前机械去除间质组织和血管第一步消化分离残留间质组织同时保持精曲小管的完整性提高静置沉降时精曲小管与间质的比重差保证沉降的精曲小管纯度减少间质成纤维细胞对 原代培养过程的污染.高龄小鼠来源 体外培养需要高密度饲养层、条件培养基和高浓度生长因子及胎牛血清支持精原干细胞原代培养克隆形成与增殖能力和饲养层种类、饲养层密度、生长因子种类、生长因子浓度、血清浓度均有密切关系 本课题组在单只高龄小鼠来源精原干细胞原代培养进行了优化改进:采用 小鼠来源胚胎成纤维细胞()作 为 饲 养层提高 饲养层密度填加条件培养基提高胎牛血清与生长因子浓度加入 受体 可溶性成分成功促进高龄小鼠 原代培养克隆形成并增殖传代保持长达 月.高龄 克隆是包含未分化和分化精原细胞的异质性克隆高龄小鼠体外培养的 克隆在逐渐降低胎牛血清浓度和饲养层密度后可维持长期稳定增殖具有干细胞的碱性磷酸酶活性免疫荧光染色显示这些 克隆表达、和 等 型精原细胞标记蛋白不表达 分化精原细胞和 精母细胞标记蛋白但是在 水平这些高龄小鼠来源 克隆除了表达、等未分化精原细胞标记物之外也表达 分化精原细胞和 精母细胞标记物研究显示在精原细胞分化以及减数分裂启动过程中主要涉及到转录后调控机制提示本研究中单只高龄小鼠来源 克隆是由未分化、分化精原细胞构成的异质性克隆与文献报道结果相符总之本研究通过在第一步消化中有效清除睾丸成纤维细胞提高精原细胞接种密度、优化饲养层和生长因子、组合等措施成功建立单只 月龄昆明白来源高龄小鼠的 体外长期培养体系该 克隆可以长期稳定传代具有干细胞活性是一株同时表达未分化和分化精原细胞标记物的异质性原代培养 细胞系 后续还需要进行 克隆同种异体移植进行功能表型鉴定 转录组、表观组学检测将有利于我们深入理解高龄小鼠来源 的基因表达和表观调控情况 本研究为高龄男性 的体外功能表型和分子机制研究提供一种新的细胞工具参考文献:.():.:.():.?.():.:.:.():./.():.():.():.():(下转第 页)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()及管理专家共识撰写组.阿尔茨海默病患者日常生活能力和精神行为症状及认知功能全面管理中国专家共识().中华老年医学杂志():等.美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会诊断指南写作组:阿尔茨海默病源性轻度认知障碍诊断标准推荐.中华神经科杂志():裴芳孟涛张凯旋等.简易智能状态检查量表和蒙特利尔认知评估量表在老年人认知功能障碍筛查中的比较.中国药物与临床():张慧敏艾永梅吴燕萍等.阿尔茨海默病生命质量测评量表()中文版信度和效度分析.中国卫生统计():简文佳时晶倪敬年等.日常生活能力量表鉴别痴呆与轻度认知损害.中国老年学杂志():.():朱振霞于浩谢文丽.阿尔茨海默症发病机制及治疗药物研究进展.武警后勤学院学报(医学版)():田金洲解恒革王鲁宁等.中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南(年版).中华老年医学杂志():.:.:.():章礼勇袁良津王玉.重复经颅磁刺激对轻度认知功能障碍患者认知功能的影响.临床神经病学杂志():黄慧贾艳滨沈拾亦.虚拟现实技术在认知康复中的研究进展.中国康复医学杂志():(收稿日期:)(上接第 页).():.:.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.().():.()().():.():(收稿日期:)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()