基于长链底物亲和的脂肪酶MAS1理性设计改造.pdf
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1、文章编号:1006-3080(2023)04-0529-07DOI:10.14135/ki.1006-3080.20220328001基于长链底物亲和的脂肪酶 MAS1 理性设计改造唐秀云1,王嘉伟2,张建国2,缪雨露3,赵玥3,高蓓1,张鲁嘉1,3,4(1.华东理工大学生物工程学院,生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.上海理工大学健康科学与工程学院,上海200093;3.华东师范大学化学与分子工程学院,上海分子治疗与新药创制工程技术研究中心,上海200241;4.纽约大学(上海)理论与计算化学联合中心,上海200122)摘要:探讨了脂肪酶 MAS1 对长链底物 4-硝基苯酚豆
2、蔻肉酸酯(pNP-C14)催化的最适温度、最适 pH、pH 稳定性,并通过分子动力学模拟计算得出结合自由能,然后根据结合自由能的差值初步筛选出了 G145W 及 T141L 两个单点突变体。实验表明,与野生型 MAS1 相比,结合自由能降低显著的突变体 G145W 的米氏常数(Km)减小了 11%,催化常数(kcat)与 Km的比值(kcat/Km)为野生型 MAS1 的 1.29 倍,突变体 G145W 对长链底物的亲和能力和催化效率均有提高;而结合自由能降低较小的突变体 T141L 的 Km值增大了 22%,kcat/Km为野生型 MAS1 的0.88 倍,说明酶与底物分子结合自由能的降低
3、并非准确的突变筛选标准。通过分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)残基拆解分析得出:残基 T38、F39、L149、F153、V202、V233 对脂肪酶活性口袋与长链底物结合的稳定性贡献较其他残基大;残基 T38、G40、N41、N45 和T237 对提高长链底物的亲和能力具有重要贡献,预测为热点残基,其结合自由能的降低可以作为突变筛选的参考标准。关键词:脂肪酶 MAS1;长链底物;动力学;MM/GBSA;热点残基中图分类号:Q55文献标志码:A长链脂肪酸在人体健康和疾病治疗中有着重要作用,尤其是 EPA、DHA 等长链多不饱和脂肪酸,具有抗炎1、抗癌2、降血脂、预防动脉粥样硬化3等生理
4、功能,在食品、医药行业具有广泛的应用前景。甘油酯型长链脂肪酸兼具稳定性和良好的消化吸收效率,具有高生理活性,但其工业化制备工艺尚未成熟,严重影响了相关产品开发与生理功效的研究。高专一性脂肪酶催化的甘油与长链脂肪酸的酯化反应是长链脂肪酸甘油酯定向加工的不二之选,但鲜有研究报道是对长链脂肪酸具有高专一性的脂肪酶,且极少针对长链脂肪酸底物特异性脂肪酶的设计改造及长链脂肪酸甘油酯定向加工的系统研究。与大多数其他酶相比,脂肪酶能接受广泛的底物并能耐受有机溶剂4。在水解、酯交换和酯化5-63 种类型的反应中,脂肪酶通过动力学拆分起作用,不同底物的链长和饱和度是导致脂肪酶作用差异的重要因素。通常,在饱和度方
5、面,脂肪酶对饱和及单不饱和脂肪酸的催化效率比对多不饱和脂肪酸的催化效率更高7。对于脂肪酸链长,目前已报道的绝大多数脂肪酶都是优先识别中短链脂肪酸,仅少数能催 化 长 链 脂 肪 酸8,如 来 自 Yarrowia lipolytica(YLL2)9、Thermomyces lanuginosus10、Pseudomonascepacia、R.miehei11、Bacillus sp.12和P.alcaligenes13的脂肪酶等。这些脂肪酶虽然能识别长链多不饱和脂肪酸,但在实际生产过程中仍存在活性不高、热稳定性欠佳、特异性不高等问题。脂肪酶 MAS1 来自收稿日期:2022-03-28基金项目
6、:国家重点研发计划(2020YFA0908400);国家自然科学基金(31772007,U1805235);上海市自然科学基金(21ZR1416500);纽约大学全球种子基金;纽约大学-华东师范大学计算化学中心(ECNU 创新 001 公众平台)作者简介:唐秀云(1994),女,安徽安东人,硕士生,主要研究方向为脂肪酶理性设计改造。E-mail:通信联系人:高蓓,E-mail:;张鲁嘉,E-mail:,ljzhangnyu.edu引用本文:唐秀云,王嘉伟,张建国,等.基于长链底物亲和的脂肪酶 MAS1 理性设计改造 J.华东理工大学学报(自然科学版),2023,49(4):529-535.Ci
7、tation:TANGXiuyun,WANGJiawei,ZHANGJianguo,et al.RationalDesignofLipaseMAS1fortheLong-ChainSubstrateAffinityJ.JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology,2023,49(4):529-535.Vol.49No.4华东理工大学学报(自然科学版)2023-08JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology529于海洋链霉菌(Streptomyces sp.StrainW007),具
8、有热稳定性良好、非区域特异性、有机溶剂耐受性高等优势,具有良好的工业运用前景。MAS1 的结构由12 个 螺旋和 6 个 链组成,其核心区域具有经典的/水解酶折叠,催化三联体由 S109、H232 和D200 残基组成,MAS1 的亲核丝氨酸位于 G-X-S-X-G 共有序列的中间14。MAS1 脂肪酶的运用很广泛,虽然能识别长链多不饱和脂肪酸15,但其最适底物仍是短链脂肪酸,对长链底物的反应活性远低于短链底物,限制了其在长链多不饱和脂肪酸的定向合成中的催化效果12。为改善 MAS1 对长链底物的活性,本文在大肠杆菌系统中异源表达了 MAS1,并测定了其酶学性质。然后,将长链底物 4-硝基苯酚
9、豆蔻肉酸酯(pNP-C14)对接进 MAS1 的活性口袋中,并进行分子动力学模拟计算(MD),最终根据结合自由能筛选出了两个单点突变;以 pNP-C14 为水解底物,测定了野生型MAS1及其突变体 T141L、G145W 的动力学常数,比较分析了野生型 MAS1 及其突变体对长链底物的亲和能力和催化效率;为进一步揭示脂肪酶对长链底物的作用机制,建立针对长链底物催化活性提升的理性设计改造的高效筛选策略,通过分子力学/广义波恩表面积(MM/GBSA)残基拆解分析,对热点残基进行了预测,分析了对长链底物亲和特性具有重要影响的关键残基。1实验部分 1.1 菌株和试剂含脂肪酶 MAS1 基因序列(Uni
10、ProtKB 编号:H0B8D412)的 pPIC9K质粒由上海捷瑞公司合成,表达 载 体 pET-22b(+)由 本 实 验 室 保 存;克 隆 宿 主Escherichia.coli(E.coil)DH5 及 表 达 宿 主 E.coliBL21(DE3)购自上海维地生物有限公司。内切酶EcoRI 和 XhoI、TaqDNA聚合酶、T4DNA 连接酶购自赛默飞世尔科技有限公司;测酶活底物 pNP-C14 购自 sigma-aldrich 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;氨苄青霉素(Amp)购自上海捷瑞生物有限公司;质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、核酸纯化试剂盒购自 Favorge
11、n 公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自翌圣生物科技(上海)有限公司;其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯。1.2 脂肪酶 MAS1 重组表达菌株的构建、表达和纯化将全基因合成的含脂肪酶 MAS1 基因的 pPIC9K质粒体作为目的基因扩增的模板;根据序列设计引物如表 1 所示,在 MAS1 基因的 N-端加入 8His 标签,插入载体 pET-22b(+)的 EcoRI和 XhoI 位点间。连接产物转化 E.coliDH5 进行质粒扩增,利用 LB(0.01g/mLNaCl,0.005g/mLLP0021 酵母提取物,0.01g/mLLP0042 蛋白胨)平板(含 100g/
12、mLAmp)筛选阳性克隆。重组质粒转化 E.coliBL21(DE3)进行表达。20、IPTG 终浓度 0.1mmol/L、220r/min过夜诱导 12h。收集菌体,用 20mmol/LPBS 缓冲液(pH7.4)重悬后,超声波破碎。20000g、4 离心20min取上清,0.22m 滤膜过滤,用含 50、500mmol/L 咪唑的 PBS 缓冲液依次洗脱,收集 500mmol/L 咪唑洗脱液,超滤脱盐,含目的蛋白的组分保存在 20mmol/LPBS 缓冲液中,BCA测定蛋白浓度用于后续实验。表1引物序列Table1SequenceofprimersPrimerSequence(53)Res
13、trictionsitesMAS1-FATAGAATTCGATGGCGACCGCGACCGCGGCCEcoRIMAS1-R ATACTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGGTGATGATGGXhoIT7-FTAATACGACTCACTATA/T7-RGCTAGTTATTGCTCAGCG/1.3 MAS1 酶学性质1.3.1标准曲线制作及酶活测定酶活单位定义为在一定反应条件下,每分钟释放 1molpNP-C14 所需酶量(U)。将 0.5、1、2、3、4mol4-硝基苯酚分别溶于 1mL、0.1g/LSDS(十二烷基磺酸钠)与 1.5mL、100mmol/LTris-HCl、75L 异丙
14、醇和 25LDMSO(二甲基亚砜)的混合液中,在 405nm 处进行吸光度测试,得到标准曲线方程。将 pNP-C14 配制成 6.25mmol/L 的异丙醇溶液,取 25L 该溶液溶于 75L 异丙醇和 DMSO 混合液(异丙醇与 DMSO 的体积比为 21),取此底物混合液 20L 与 180L、20mmol/LPBS(磷酸盐)缓冲液(pH7.4)加入 96 孔酶标板中混匀,40孵育 10min后用移液枪吸取 100L 混合物加入 50L适当稀释的酶液混合,在测定温度下反应 10min,测定 OD405,经标准曲线换算得到酶活。1.3.2最适温度分别在 30、35、40、45、50、55下测
15、定脂肪酶 MAS1 的水解活性。1.3.3最适 pH 及 pH 稳定性分别在 pH6.0(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)、pH6.58.0(PBS 缓冲液)、pH8.5(Tris-盐酸缓冲液)、pH9.010.0(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)的缓冲液中,按照 1.3.1 节中所述方法测定530华东理工大学学报(自然科学版)第49卷脂肪酶 MAS1 的水解酶活;将酶液分别超滤置换于pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 的缓冲液中,在 4 放置 4h,再在 40 下测定残余酶活。1.4 动力学模拟及突变体筛选一般来说,突变以后酶的最适温度、pH 等都会发生变化,但无法
16、对所有突变点都在最适条件下进行模拟分析,因此本文采用常温、常压、pH 中性的环境进行模拟,以便于对比分析。利用薛定谔软件将底物 pNP-C14 对接进脂肪酶 MAS1 的活性口袋中,使用 Amber 进行分子动力学模拟。首先,进行动力学模拟前的预处理,蛋白质用 ff14SB 力场获得具体的参数,pNP-C14 用 AM1-BCC 计算电荷,leaprc.gaff力场获得小分子的具体信息,leap 模块加氢,将体系放在 TIP3P 的水盒子面,复合物体系最近的原子和水盒子的边缘设置为 1.0109m,加入抗衡离子维持体系的电中性。然后,进行两步优化:第 1 步优化是用2.0921026J/(mo
17、lm2)的力限制蛋白小分子复合物,优化溶剂,首先进行了 5000 步的最速下降法,然后是 5000 步的共轭梯度法进行优化;第 2 步优化是整个体系的优化,不加任何限制,首先进行了 25000 步的最速下降法,然后是 25000 步的共轭梯度法进行优化。优化结束后,在 300ps 的时间内将体系温度从 0 升高到 300K,不加限制地进行 50ns 的动力学模拟。在模拟过程中,用 SHAKE 算法限制住所有含氢原子的化学键。选择最后 10ns 轨迹用于结合自由能计算,针对小分子 pNP-C14 周围 51010m 的残基进行虚拟饱和突变,分步计算脂肪酶 MAS1 与底物 pNP-C14 的结合
18、自由能(G)。比较突变体(mut)与野生型(wt)的结合自由能的差值(G=GmutGwt),选取 G 值低的突变点进行重组构建。1.5 突变体构建及表达纯化通过 PCR 扩增突变点上下游的基因片段,再设计上下游引物进行融合 PCR,所用引物如表 2 所示。扩增得到的目的基因序列经 EcoRI 和 XhoI 双酶切后与质粒连接,构建好的质粒转入克隆宿主 E.coliDH5,经扩大培养抽提质粒后转入表达宿主 E.coliBL21(DE3)。构建好的重组菌株在 20、IPTG 终浓度 0.1mmol/L、220r/min 过夜诱导 12h。破碎液离心后收集上清,分别用含 50、500mmol/L 咪
19、唑的洗脱液依次洗脱,收集 500mmol/L 咪唑洗脱液,超滤脱盐后用于后续实验。1.6 动力学参数测定以 pNP-C14 为底物,从 0.053.00mmol/L 中选取 9 个浓度梯度,加入定量的酶溶液,在最佳反应条件下反应,每组 3 个平行,根据 OD405数值计算反应速率。根据双倒数法,绘制 1/V 对 1/c 曲线,并进行线性拟合;拟合所得直线在 X 轴的截距为 1/Km,在Y 轴的截距为 1/Vmax。2结果与讨论 2.1 脂肪酶 MAS1 酶学性质研究由于酶对不同底物作用的最适条件不同,为了研究脂肪酶 MAS1 对长链底物的亲和性能,选取了长链底物 pNP-C14 作为底物,对该
20、酶酶活的最适温度、最适 pH 及 pH 稳定性重新进行了测定。在pH7.4 的条件下,分别测定了 30、35、40、45、50、55脂肪酶 MAS1 的水解活性,结果表明 MAS1 的最适作用温度为 40,将 40 测得的酶活设定为 100%,结果见图 1。当温度低于 40 时,随着温度的上升,MAS1 的水解酶活逐渐升高,并在 40 时达到最大值;温度继续升高至 45 时,酶活损失不大,继续升至 50 时酶活骤然下降至低于最高酶活的 40%;温度到达 55 时,MAS1 酶活仅残留 10%左右。025303540Temperature/Relative activity/%455055204
21、06080100图1温度对脂肪酶 MAS1 酶活的影响Fig.1EffectoftemperatureonthelipaseMAS1activity分别测定了 pH6.010.0 条件下的酶活,测得的结果表明 MAS1 的最适 pH 为 9.5,将此 pH 测得的酶表2定点突变构建引物序列Table2Primersusedinsite-directedmutagenesisPrimerSequence(53)T141L-1RGAGGCCGAGCAGCGTGAGGCCGTGGTTGTCCGGT141L-2FCCGGACAACCACGGCCTCACGCTGCTCGGCCTCG145W-1RCGGC
22、AGCAGCTTGGTGAGCCAGAGCAGCGTGGTGCCGTGG145W-2FCACGGCACCACGCTGCTCTGGCTCACCAAGCTGCTGCCGMAS1-FATAGAATTCGATGGCGACCGCGACCGCGGCCMAS1-RATACTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGGTGATGATGG第4期唐秀云,等:基于长链底物亲和的脂肪酶MAS1理性设计改造531活设定为100%,pH 对MAS1 酶活的影响结果如图2(a)所示。脂肪酶 MAS1 在酸性环境中活性很低,pH6.0 时的酶活不足最高酶活的 10%;最初随着 pH 值的升高,酶活逐渐提高,pH9.5 时酶
23、活达到峰值;pH 继续升高至 pH10.0 时,酶活下降了近 40%,说明该酶是偏碱性酶,在酸性环境中酶活损失严重。按1.3.3 节描述的方法孵育结束后测定残余酶活,将图 2(a)中测得的相应 pH 下的酶活数值定义为 100%,如图 2(b)所示,脂肪酶 MAS1 在酸性环境中比较稳定,残余酶活保持在 80%以上;在碱性环境中稳定性较差,残余酶活均低于 50%,pH 升高至 10.0 时残余酶活接近 0。05.5 6.0 6.5 7.0pHRelative activity/%7.58.59.5 10.08.09.05.5 6.0 6.5 7.0pH7.58.59.5 10.08.09.02
24、0406080100(a)(b)0Residual relative activity/%20406080100图2最适反应pH(a);pH 稳定性(b)Fig.2OptimalpH(a);stabilityofpH(b)2.2 突变位点的初筛脂肪酶 MAS1 已有晶体结构报道(PDB 编号:5G6B),小分子 pNP-C14 结构从 Pubchem 网站下载获得(CompoundCID:84555),将小分子能量最小化处理后进行薛定谔对接。脂肪酶 MAS1 是一种典型的丝氨酸水解酶,催化三联体由 S109、H232 和 D200残基组成,其催化酯水解反应由酰基化和去酰基化两步组成。在酰基化步
25、骤中,丝氨酸的 OG 原子对底物的羰基碳进行亲核攻击,形成四面体过渡态,随后发生键断裂,释放出醇,脂肪酶链的羰基碳原子依旧与丝氨酸的 OG 原子连接,形成脂肪酸链酯;在去酰基化步骤中,水分子中的羟基氧原子亲核攻击丝氨酸的羰基碳原子,释放出脂肪酸,脂肪酶恢复游离状态,而脂肪酶只能在酰基化步骤期间进行底物选择16。因此,模拟酰基化步骤进行对接分析,选取S109 的 OG 原子和 pNP-C14 的酯基 C 原子为限制性对接位点,构象优化后限制距离为 5.381010m,取边长为 2.11011m 的正方体盒子,力场采用软件OPLS-2005,打分函数为 GlideSP,对接后保留打分(Gscore
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