基于网络药理学和分子对接技术探讨沙棘活性成分对非酒精性脂肪肝作用机制.pdf
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1、护理研究 2023 年 8 月第 37 卷第 16 期(总第 732 期)基于网络药理学和分子对接技术探讨沙棘活性成分对非酒精性脂肪肝作用机制高健1,吴胜男1,王晓静2,纪景馨2,张然2,程景民1*1.山西医科大学管理学院,山西 030001;2.山西医科大学公共卫生学院Study on mechanism of active ingredient in seabuckthorn on nonalcoholic fatty liver based on network pharmacology and molecular dockingGAO Jian,WU Shengnan,WANG Xia
2、ojing,JI Jingxin,ZHANG Ran,CHENG JingminSchool of Management,Shanxi Medical University,Shanxi 030001 ChinaCorresponding Author CHENG Jingmin,Email:Abstract Objective:To analyze and study the molecular mechanism of active ingredients of sea buckthorn on non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)through
3、 network pharmacology and molecular docking technology.Methods:The highthroughput sequencing data of NAFLD was retrieved from the GEO database,and the differential expression analysis of the R language edgeR package was used to obtain the intersection of the differential genes and the corresponding
4、targets of key components of sea buckthorn retrieved from the TCMSP database to obtain potential targets of sea buckthorn to interfere with NAFLD.Gene set enrichment analysis was used to study potential targetrelated cellular functions and signaling pathways,and Cytoscape was used to construct a com
5、ponenttargetpathway interaction network.Subsequently,protein interaction network analysis(PPI)and network topology analysis(Degree)were performed to determine the core intervention targets,and the virtual docking of core targets and core components was performed through AutoDock Vina and PyMOL open
6、source tools to predict the relationship between ligands and receptors.molecular mechanism of action.Results:The componenttargetpathway network was constructed by 159 nodes and 387 pairs of interactions.Molecular docking results showed that 10 active substances,including quercetin,flavonoids,kaempfe
7、rol,linolenic acid,isorhamnetin,myricetin,coumarin,ursolic acid,rutin and stigmasterol,interact with JUN,MMP9,FGF2,VCAM1,CDKN1A,ACE,SERPINE1,SPP1,NOS3 and CCNA2,these 10 core targets have high affinity.Functional enrichment and pathway enrichment analysis mainly obtained biological processes of fatt
8、y acid synthesis and metabolism.62 active ingredients such as quercetin in sea buckthorn were shown to interfere with the development of NAFLD by regulating 61 targets such as transcription factor JUN.Conclusion:A variety of active components in sea buckthorn may play a role in preventing or interve
9、ning in the development of NAFLD by affecting lipid accumulation,reducing inflammatory response and scavenging reactive oxygen species through multiple targets and multiple pathways.The organic acids such as ursolic acid rich in sea buckthorn have great potential to interfere with NAFLD.Keywords tra
10、nscriptomics;seabuckthorn;nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD;network pharmacology;molecular docking摘要 目的:通过网络药理学以及分子对接技术对沙棘活性成分干预非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的分子作用机制深入分析研究。方法:在 GEO 数据库检索非酒精性脂肪肝病的高通量测序数据,通过 R 语言 edgeR 包差异表达分析后,将差异基因与 TCMSP数据库检索到的沙棘关键成分对应靶点取交集,得到沙棘干预非酒精性脂肪肝病的潜在靶
11、点。利用基因集富集分析,研究潜在靶点相关细胞功能和信号通路,并使用 Cytoscape构建成分靶点通路三者作用网络。随后进行蛋白质互作网络(PPI)和网络拓扑分析 Degree确定核心干预靶点,并通过 AutoDock Vina和 PyMOL开源工具进行核心靶点与核心成分的虚拟对接工作,预测配体与受体之间的分子作用机制。结果:成分靶点通路网络由 159个节点以及 387对互作关系构建而成。分子对接结果显示,槲皮素、黄酮、山柰酚、亚麻酸、异鼠李素、杨梅黄酮、香豆素、熊果酸、芦丁和豆甾醇共 10 种活性物质与 JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1
12、、NOS3和 CCNA2 10个核心靶点有较高亲和性。功能富集和通路富集分析主要得到脂肪酸合成与代谢的生物过程。沙棘中槲皮素等 62种活性成分显示通过调节转录因子 JUN 等 61个靶点影响干预非酒精性脂肪肝病的发展。结论:沙棘中多种活性成分可能通过多靶点、多通路影响脂质积累、减弱炎症反应和清除活性氧从而发挥预防或干预非酒精性脂肪肝病病情发展的作用。沙棘中富含的熊果酸等有机酸干预非酒精性脂肪肝病潜力巨大。关键词 转录组学;沙棘;非酒精性脂肪肝;网络药理学;分子对接doi:10.12102/j.issn.1009-6493.2023.16.001非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fat
13、ty liver disease,NAFLD)包 括 脂 肪 变 性、脂 肪 肝 炎(non alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化,最终导致肝硬化及肝细胞癌症的广泛性系列疾病1。据流行病学调查数据显示,全球成人非酒精性脂肪肝病的患病率高达23%25%,其中 20%非酒精性脂肪肝病病人受脂肪肝炎的影响2。现阶段,在“二次打击”学说不断发展的基础上,针对除脂肪变性、氧化应激以外的胰岛素抵抗、线粒体功能紊乱、脂质毒性等多重平行打击在致病机制方面表明,非酒精性脂肪肝病为多种危险因素的相互作用导致34。考虑到非酒精性脂肪肝病受基因遗传、表观遗传和环境暴露等诸多复杂因素
14、的相互影响,除使用非针对性药物治疗或接受身体运动的建议 科研论著 基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目,编号:71804102;山西省高校教学改革创新项目,编号:J2021261作者简介 高健,硕士研究生在读通讯作者 程景民,Email:引用信息 高健,吴胜男,王晓静,等.基于网络药理学和分子对接技术探讨沙棘活性成分对非酒精性脂肪肝作用机制J.护理研究,2023,37(16):28532861.2853CHINESE NURSING RESEARCH August,2023 Vol.37 No.16以外5,现阶段提出的“营养遗传学”和“营养表型基因组学”,通过研究饮食暴露与基因组的相互作
15、用,改善临床与健康营养实践5。同时,植物提取物的多种活性成分、多种药理作用在非酒精性脂肪肝病实验模型中展现潜在多靶向效应3。于是,膳食管理和植物营养干预非酒精性脂肪肝病应运而生。沙棘果、沙棘叶和沙棘籽包含多糖、多酚和氨基酸等活性物质种类丰富,药理作用明显68。沙棘叶和沙棘果的提取物抑制糖基化终产物的形成9,沙棘油富含的山柰酚可减弱细胞的氧化应激和脂质积累10,沙棘汁在抑制炎症和预 防 代 谢 性 综 合 征、神 经 退 行 性 疾 病 中 发 挥 重 要作用8。随着非酒精性脂肪肝病和沙棘相关研究的不断深入,单靶点单成分的研究模式已无法完全解释其治疗作用。本研究通过构建多成分多靶点多信号通路的关
16、联网络探究沙棘对非酒精性脂肪肝病的综合干预方式,对非酒精性脂肪肝病的发病、进展以及沙棘活性成分干预机制有着重要意义,为后续进一步探索沙棘治疗非酒精性脂肪肝病相关作用机制提供理论依据。1 资料与方法 1.1沙棘成分的获取在TCMSP数据库(https:/ Uniprot数据库(https:/www.uniprot.org/)规范蛋白质名称后将其转化为基因名称(gene symbol)。考虑检索到的沙棘成分以及成分对应靶点数目较少,且沙棘作为食品可直接食用,故暂不考虑使用常用参数药物相似度(DL)、口服生物利用度(OB)等对其进行过滤筛除。1.2非酒精性脂肪肝差异表达基因的筛选在 GEO 数据库(
17、https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中选择表达谱 GSE126848 高通量测序数据集做差异表达分析。将数据矩阵中“健康人群(healthy normal weight)”和“健康肥胖(obese)”作为对照组,“单纯性脂肪变性(NAFL)”和“非酒精性脂肪性肝炎”作为试验组。对照组与试验组的测序数据统一为基因名称(gene symbol)后,使 用 R(4.1.3)“limma”包 以 P0.05、|LogFC|1 为临界阈值筛选差异基因并绘制火山图。其中,数据集中体重正常和肥胖受试者显示正常的肝脏组织学。1.3沙棘影响非酒精性脂肪肝病的潜在靶点预测沙棘成分的对
18、应靶点基因与非酒精性脂肪肝病差异 表 达 的 基 因 在 JVENN 在 线 网 站(http:/jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)绘 制 韦 恩 图(Venn),其中交集基因即沙棘干预非酒精性脂肪肝病的潜在靶点。1.4构建蛋白质互作网络(PPI)将沙棘干预非酒精性脂肪肝病的潜在靶点导入STRING 网站(https:/cn.stringdb.org/)构建靶点蛋白之间的关系网络图(medium confidence:0.4)。将PPI网络关系图导入 Cytoscapev 3.9.0平台可视化并借助 Cytohubba工具计算 Degree度值。1
19、.5 基 因 本 体(GO)功 能 富 集 与 基 因 组 百 科 全 书(KEGG)通路富集将潜在靶点的 gene symbol使用 org.Hs.eg.db R 包转化为 Entrez ID 后,clusterprofiler、enrichplot R 包对潜在靶点进行生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)做 GO 功 能 富 集 和 KEGG 通 路 富 集(FDR0.05)。筛选 BP、CC 和 MF 三者富集数量排序均居前 10 位的结果通过 ggpubr
20、包绘制 GO 功能富集的条形图。借助 ggplot 2包将 KEGG 信号通路的全部结果可视化绘制气泡图。1.6成分靶点通路网络的构建沙棘成分、靶点信息和信号通路的相互关系导入Cytoscape(v 3.9.0)平 台 构 建 成 分 基 因 通 路 分 析网络。1.7分子对接验证分析使用网络拓扑分析 Degree 算法筛选出前 10 个基因作为核心靶点,并利用 RCSB 数据库(https:/www.rcsb.org/)、AlphaFold数据库(https:/alphafold.ebi.ac.uk/)和 TCMSP 数据库(http:/ 10 个活性分子的三维结构信息。有效成分和经PyMO
21、L 2.2.5 去除多余配体的靶点蛋白在 AutoDock Tools 1.5.7软件分别去除水分子、补全氢分子,选定受体、配体后输出为 PDBQT 文件。调整靶点蛋白 Grid Box 参数使其对接范围包含全部的蛋白质结构。在AutoDock Vina 软件中完成核心成分与靶点之间的对接,记录其亲和性并用 pheatmap R 包绘制对接结果热图进行分析。沙棘的 10 种活性成分与其亲和性最高的非酒精性脂肪肝病核心靶点在 PyMol 中进行分子对接的可视化。2 结果 2.1沙棘干预非酒精性脂肪肝病潜在靶点的获取在 TCMSP 数据库检索到沙棘有效成分 223 种,剔除未检索到靶点的成分和删除
22、重复选项后,得到138 种 活 性 成 分 与 574 个 靶 点 蛋 白 的 关 系 信 息。GSE126848测序数据包含健康群体(14例)、健康肥胖(12例)、单纯非酒精性脂肪变性(15例)和非酒精性脂肪肝炎(16 例)4 组信息。将对照组(健康群体和健康 2854护理研究 2023 年 8 月第 37 卷第 16 期(总第 732期)肥胖)26 例样本与试验组(脂肪变形和脂肪肝炎)31例样本的表达谱信息转化为 13 569 个基因矩阵信息后,以 P0.05、|LogFC|1 为过滤条件筛选非酒精性脂肪肝病的差异表达基因。非酒精性脂肪肝病差异表达基因共 1 188 个,其中上调表达 62
23、7 个,下调表达561 个,采用 limma R 包对数据矩阵进行差异分析,代表上调基因的红色圆点共 627 个,代表下调基因的蓝色圆点共 561 个,灰色部分代表的基因被认为差异表达不显著。详见图 1。574 个沙棘靶点与 1 188 个非酒精性脂肪肝病靶点的交集,共 61 个关联靶点。详见图 2。2.2蛋白质互作网络的构建61 个 影 响 非 酒 精 性 脂 肪 肝 病 的 潜 在 基 因 在STRING 网站检索后蛋白质互作网络关系图见图 3。将 网 络 关 系 导 入 Cytoscape 平 台,其 中 TCF7L1、PCDH12、PDXP、B3GAT1、MAPK8IP2、HS3ST3
24、A1、NT5M、SLC16A6 和 CBS 这 9 个靶点基因由于独立于主要网络关系暂不纳入分析。按照网络拓扑分析计算 Degree 值排序,选取 Degree 值居前 10 位的基因(JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3、CCNA2)作为核心靶点做深入研究分析,详见图 4,图中颜色深浅反映网络拓扑分析 Degree关系强弱。2.3GO功能富集与 KEGG通路富集利用 clusterprofiler 包富集 61 个潜在靶点主要的细胞功能与信号通路并将其可视化,GO 功能富集主要富集到对异源刺激反应、活性氧反应、镉离子的反应、营养反
25、应、调节血管形成、脉管系统发展相关生物过程,详见图 5;KEGG 信号通路主要富集到细胞周期、p53 信号通路、动脉粥样硬化、AGERAGE信号通路、细胞衰老、缺氧诱导因子1(HIF1)信号通路等信号通路。详细见图 6。图 3沙棘干预非酒精性脂肪肝病潜在靶点蛋白质互作网络图(基于 STRING 网站)图 2沙棘干预非酒精性脂肪肝病潜在靶点韦恩图图 4沙棘干预非酒精性脂肪肝病潜在靶点蛋白质互作网络图(基于 Cytoscape平台)图 1沙棘干预非酒精性脂肪肝病潜在靶点火山图 2855CHINESE NURSING RESEARCH August,2023 Vol.37 No.162.4成分靶点通
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