黄瓜CsGDSL脂解酶基因的克隆与表达分析.pdf
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1、华北农学报():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金面上项目()作者简介:高璐瑶()女黑龙江哈尔滨人在读博士主要从事黄瓜分子育种研究通信作者:杜亚琳()女河南漯河人高级实验师硕士主要从事黄瓜分子育种研究黄瓜 脂解酶基因的克隆与表达分析高璐瑶曹嘉健王春华武 涛杜亚琳(.湖南农业大学 园艺学院湖南 长沙.园艺作物种质创作与新品种育种工程研究中心湖南 长沙.农业农村部园艺作物(蔬菜、茶叶等)基因资源评价利用重点实验室湖南 长沙)摘要:脂解酶是影响角质层发育的重要基因克隆黄瓜 脂解酶基因并分析其表达模式旨在为黄瓜角质层发育及黄瓜果实光泽的研究奠定基础 根据黄瓜基因组数据库中的参考序列对黄瓜 脂解酶基因
2、进行克隆并进行生物信息学分析 利用 技术明确该基因在黄瓜各组织部位中的表达情况 以 份光泽性不同的黄瓜为材料对该基因序列进行克隆以明确该基因在不同光泽性黄瓜中的作用 对黄瓜 脂解酶基因启动子进行克隆并分析其作用元件 参照黄瓜基因组数据库设计扩增引物进行 扩增获得 基因 长度 编码 个氨基酸二级结构以无规卷曲(.)与 螺旋(.)为主该基因在进化过程中较为保守与甜瓜 亲缘关系最为紧密在黄瓜花后 的子房中表达量较开花 的子房高在 个品种中 基因 序列保守 基因与逆境胁迫、激素及光等具有响应 获得了 脂解酶基因明确了其在黄瓜不同组织部位中的表达情况该基因在不同材料中较为保守由此推测黄瓜 可能影响黄瓜果
3、皮光泽关键词:黄瓜角质层 基因脂解酶中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.(.):.(.)(.).:华 北 农 学 报 卷 黄瓜(.)是我国重要的蔬菜作物之一其口味清爽、品种多样深受广大消费者喜爱 ()基因参与表皮角质的聚合过程影响脂质、次级代谢产物和细胞壁生物合成等主要过程 明确黄瓜中 的表达模式有助于进一步探究 影响黄瓜角质层发育的作用机制为黄瓜表皮光泽的研究奠定基础 表皮光泽是蔬菜作物重要的商品性状之一光泽性较强的蔬菜在市场上更具有竞争力 表皮光泽作为外观性状必然与植物表皮组分差异有着一定的联系植物表皮主要成分为角质层是植物表皮外的一层疏水保护层形成于陆生植物表皮细胞壁外表
4、面的脂质保水层 其通常由角质和蜡质组成而蜡质则又分为内层蜡质与外层蜡质外层蜡质通常称为蜡粉角质是角质层的主要结构成分其主要组分是聚酯 这三者均对植物表皮的形态特征有所影响 脂肪酶属于/水解酶折叠蛋白超家族其二级结构一般由多个 螺旋、折叠组成在调节植物生长发育、抗逆性和组织器官的形态建成等众多方面发挥着关键的作用 目前 等发现在具有光泽的高粱突变体的叶和秆表面上表皮蜡积累发生变化对其遗传图谱进行分析发现注释为 的基因座最可能与表皮蜡沉积相关的基因 等研究表明当对番茄 基因进行 干扰时部分转基因植株番茄果实由于角质层沉积发生缺陷角质层厚度变薄番茄果皮光泽性变强 等发现在番茄果皮光泽性强的突变体中其
5、蜡质、角质的含量和构成物以及角质层厚度等方面都有一定变化对其中的角质缺陷突变体进行遗传作图发现存在一个具有剪接突变的 基因 以光泽性不同的 份辣椒为材料进行转录组测序分析结果表明基因在提高角质含量中起着重要作用虽然前人已在番茄中初步研究了 基因对于植物角质层及果实表皮光泽的影响但在黄瓜中关于 基因的克隆与表达模式分析的研究尚未报道本研究参考葫芦科基因组数据库对 基因进行克隆 通过蛋白序列比对以及进化树构建分析黄瓜 脂解酶基因的保守性并通过 技术明确了该基因在黄瓜不同组织部位中的表达差异 材料和方法.试验材料本试验研究材料为黄瓜种质创新与遗传改良团队实验室繁育的高代自交系华南型黄瓜 于 年 月种
6、植于湖南农业大学耘园基地大棚中(长沙)取茎、卷须、根、生长点、开花当天的雄花与雌花以及 的子房 所有材料取后立即置于液氮中保存在 的超低温冰箱中备用本研究所有克隆引物由软件 .设计北京擎科生物科技有限公司合成并测序(表)表 引物信息.引物名称 引物序列()()用途基因 扩增基因启动子扩增.总 的提取与 第一链的合成 法(全式金北京)提取茎、卷须、根、生长点、开花当天的雄花、雌花以及 的子房的总试验步骤参照说明书 以总 为模板反转录合成 第 链(诺唯赞南京)置于 备用 反转录程序如下第 步:()(/)补至 将反应液于 加热 迅速置于冰上骤冷并在冰上静置 第步:取 加于上述反应液中用移液器轻轻吹打
7、混匀 第步:反应液中加入 保存.黄瓜 基因的克隆与序列分析以反转录得到的 为模板参照黄瓜基因组数据库(:/./)检索出的 基因序列设计基因特异性引物利用高保真酶进行 扩增(诺唯赞南京)以克隆目的基因 反应体系如下:(/)补 至 反 应 程 序:次循环 保存 产物经 琼脂糖凝胶电泳分析并回收目的条带连接 载体(擎科北京)转化大肠杆菌选取阳性克隆测序.基因的生物信息学分析利用 (:/./)分析 基因结构 通过 (:/./)分析 理化 期高璐瑶等:黄瓜 脂解酶基因的克隆与表达分析 性质如相对分子质量、等电点等 使用(:/./.?.)预测该基因二级结构(:/./.?)预测该基因三级结构 根据 的氨基酸
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