CytochalasinH对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca%5E%282%2B%29_CaN_NFAT信号通路的影响.pdf
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1、广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023邓小林,饶乐怡,徐静.Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响J.广东海洋大学学报,2023,43(4):19-26.收稿日期:2023-02-14基金项目:2022年度海南大学协同创新中心项目(XTCX2022STB01);海南省重大科技项目(ZDKJ202008/ZDKJ202018);海南省重点研发项目(ZDYF2021108);国家自然科学基金(8197322
2、9/82160675);广东省海洋药物重点实验室开放课题(LMM2021-4)第一作者:邓小林(1998),硕士研究生,研究方向为红树林微生物代谢产物的免疫抑制药理活性机制。E-mail:通信作者:徐静(1981),教授,研究方向为海南特有药用植物和红树林微生物天然产物化学以及药物先导化合物的开发。E-mail:Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响邓小林,饶乐怡,徐静(海南大学生态文明协同创新中心/海南大学化学工程与技术学院 海南省精细化工工程技术研究中心,海南 海口 570228)摘要:【目的】研究红树林植物大红树内生真菌Pho
3、mopsis asparagi DHS-48得到的次级代谢产物cytochalasin H对小鼠(Mus musculus)脾细胞的免疫抑制活性及其作用机制。【方法】用不同浓度(3、6、12、25、30 mol/L)cytochalasin H处理小鼠脾细胞,通过CCK-8活力测定法检测其对刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测cytochalasin H对小鼠脾细胞凋亡的影响;免疫荧光实验检测cytochalasin H对细胞中NFAT入核及钙离子内流的影响;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune sorbent a
4、ssay,ELISA)和免疫蛋白印迹法(Western blotting)测定cytochalasin H对脾细胞中NFAT信号通路的影响。【结果】CCK-8实验表明,cytochalasin H对于正常小鼠脾淋巴细胞的毒性比环孢菌素(Cyclosporin A,Cs A)弱,半抑制浓度IC50=(35.07 1.16)mol/L;流式细胞术显示,cytochalasin H对ConA刺激的脾淋巴细胞无促凋亡作用;cytochalasin H对ConA诱导增殖的小鼠脾淋巴细胞具有显著的抑制效果,IC50=(14.810.81)mol/L,且呈剂量依赖性;免疫荧光结果表明,cytochalasi
5、n H在浓度为15 mol/L时显著地抑制了钙离子内流;Western Blotting结果显示cytochalasin H对脾淋巴细胞中CaN、NFAT蛋白(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)的表达具有显著的抑制作用;免疫荧光结果显示,cytochalasin H抑制细胞浆内的NFAT转移到细胞核;ELISA测试结果证明,cytochalasin H能显著抑制下游细胞因子白介素-2(IL-2)的分泌(=0.05)。【结论】Cytochalasin H通过抑制Ca2+/CaN/NFAT信号通路转导显著抑制T细胞增殖和活化。关键词:cytochal
6、asin H;T细胞增殖;细胞凋亡;Ca2+/CaN/NFAT信号通路;免疫抑制剂中图分类号:R967文献标志码:A文章编号:1673-9159(2023)04-0019-08doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.003Inhibitory Effect of Cytochalasin H on the Proliferation of Mouse SpleenCells and Its Effects on Ca2+/CaN/NFAT Signaling PathwayDENG Xiao-lin,RAO Le-yi,XU Jing(Collaborativ
7、e Innovation Center of Ecological Civilization,Hainan University/Hainan Provincial FineChemical Engineering Research Center,College of Chemical Engineering and Technology,HainanUniversity,Haikou 570228,China)第43卷广东海洋大学学报Abstract:【Objective】To study the immunosuppressive activity and mechanism of the
8、 secondarymetabolite cytochalasin H obtained from the endophytic fungus Phomopsis asparagi DHS-48 of themangrove plant Rhizophora mangle on mouse splenocytes.【Method】Mouse splenocytes weretreated with different concentrations of cytochalasin H(3,6,12,25,30 mol/L),and its inhibitoryeffect on Concanav
9、alin A(ConA)-induced proliferation of mouse splenocytes was detected by CCK-8assay.The effect of cytochalasin H on the apoptosis of mouse splenocytes was detected by flowcytometry.The effect of cytochalasin H on the nuclear entry of NFAT and the influx of calcium ions incells was detected by immunof
10、luorescence experiment.Enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA)and western blotting were used to determine the effect of cytochalasin H on NFAT signaling pathway insplenocytes.【Result】CCK-8 assay showed that cytochalasin H had a small toxic effect onlymphocytes,compared with Cyclosporin A(Cs A)(hal
11、f maximal inhibitory concentration IC50=35.07 1.16 mol/L).Flow cytometry showed that cytochalasin H did not promote apoptosis of spleenlymphocytes stimulated by ConA.Cell proliferation assays showed that cytochalasin H inhibited theproliferation of ConA-induced T murine splenic lymphocyte(IC50=14.81
12、 0.81 mol/L)in a dose-dependent manner.Immunofluorescence showed that cytochalasin H significantly inhibited calciuminflux at the concentration of 15 mol/L.Western Blotting showed that cytochalasin H significantlyinhibited the expression of nuclear factor of activated T-cells(NFAT)in spleen lymphocy
13、tes.Immunofluorescence showed that cytochalasin H inhibited the transfer of NFAT from cytoplasm tonucleus.ELISA showed that cytochalasin H decreased the secretion of the downstream cytokineinterleukin-2(IL-2)(=0.05).【Conclusion】Cytochalasin H significantly inhibits T cell proliferationby inhibiting
14、Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway transduction.Key words:cytochalasin H;T cell proliferation;cell apoptosis;Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway;immunosuppressant免疫抑制药物是指对机体的免疫反应具有抑制作用的药物,能够抑制机体发生的异常的免疫反应,临床上广泛应用于引起超敏反应性疾病、器官移植手术后的抗排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗1-4。常用的免疫抑制药物主要有环孢菌素 A(Cs A)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素(Rapamycin)、霉酚
15、酸脂(Mycophenolate mofetil)等,但由于上述免疫抑制剂和其他免疫抑制剂(如糖皮质激素等)具有严重的毒性,影响肾脏、神经和胃肠道系统,且很多临床上使用的免疫抑制剂的有效剂量与中毒剂量非常接近,因此开发安全有效的新型免疫抑制药物是急需的5-7。T淋巴细胞在免疫应答中起着关键作用,当其受刺激激活后,引发细胞内Ca2+浓度的改变,导致免疫细胞功能紊乱,如能够促进细胞内的转录因子从细胞质向细胞核易位,其中最典型的例子就是Ca2+/CaN/NFAT(钙离子/钙调蛋白磷酸酶/活化T细胞核因子)信号通路,当胞内Ca2+浓度增加,CaN被活化,导致NFAT去磷酸化并发生核易位,从而发挥T淋巴
16、细胞免疫应答功能8-10。红树林内生真菌可产生许多结构独特和生物活性多样的次生代谢物,被认为是最关键和最有前途的生物活性天然产物来源之一11-12。超过50%的红树林内生真菌生物活性次生代谢物是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)真菌产生的,其中拟盘多毛孢属(Pestalotiopsi)、链格孢属(Alternaria)和拟茎点霉属(Phomopsis)是主要的次级代谢物生产者13。拟茎点霉属(Phomopsis)真菌具有 900 多个宿主,近年来引起了天然产物研究者的广泛关注14-15。从中分离出了多种生物活性代 谢 物 如 dicerandrols16、ph
17、omopchalasins B-C17、phompsichalasin18、cytochalasins J1-J3、cytochalasinsH1-H219和cytosporone U20等。本课题组从海南红树林大红树来源的内生真菌 Phomopsis asparagi DHS-48 中发现了化合物20第4期邓小林等:Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响cytochalasin H,化学结构鉴定为细胞松弛素H(cytochalasin H),初步发现 cytochalasin H 能够显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖21-22
18、。但是,cytochalasinH对小鼠脾细胞生物学行为的影响和分子机制尚未见报道。因此,本研究采用CCK-8法、流式细胞术、ELISA实验、免疫荧光实验、Western blotting等,对cytochalasin H的具体作用机制进行了研究,为高效低毒免疫抑制剂的开发与利用提供了理论基础和实验依据。1 材料与方法1.1 化合物分离与纯化Cytochalasin H是本课题组前期从海南红树林大红树来源的内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48中分离纯化得到21-22。1.2 小鼠和试剂4 6周的BLAB/c小鼠,购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,无特定病原体(SPF级
19、)条件下饲养。实验前按照文献23方法制备小鼠脾细胞悬液。RPMI 1640培养基、增强型RIPA裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)制备试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)、红细 胞 裂 解 液、聚 偏 二 氟 乙 烯 膜(PVDF,孔 径0.45 m)、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、5 蛋白上样缓冲液、磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.2 7.4,经0.1 m无菌滤膜过滤)均购于武汉博士德生物工程有限公司;细胞凋亡检测试剂盒购于南京诺唯赞有限公司;NFAT Rabbit mAb、CaN Rabbit mAb购于CST;HRP-山羊抗兔IgG购于武汉
20、塞维尔生物有限公司;胎牛血清购于美国 Gibco;环孢菌素 A(Cs A)、刀豆蛋白A(ConA)购于美国Sigma;Fluo-4/AM购于碧云天有限公司;小鼠白介素-2(IL-2)ELISA试剂盒购于上海抚生实业有限公司;其他常用化学试剂购于广州化学试剂厂。1.3 钙离子浓度检测实验前将试剂盒内钙离子荧光探针Fluo-4 AM分装。6孔板每孔加入1 mL制备好的脾细胞悬浮液(1 107mL-1),药物处理1 h后(药物cytochalasinH 终浓度 15 mol/L)加 ConA 处理 0.5 h,然后收集清 洗 3 遍 后,用 荧 光 探 针 Fluo-4 AM(终 浓 度0.5 mo
21、l/L)孵育30 min,然后清洗3次后,滴加适量细胞悬液在显微镜载玻片上,立即激光共聚焦显微镜下检测荧光。1.4 小鼠脾细胞毒性检测96孔板每孔加入100 L制备好的脾细胞悬浮液(1 107mL-1),放入培养箱4 h以稳定细胞。空白组:每孔加入100 L含体积分数0.2%二甲基亚砜DMSO的完全培养基;药物组:每孔加入 100 L 用 RPMI1640完全培养基稀释的不同浓度的cytochalasin H或Cs A,使药物cytochalasin H和Cs A的终浓度分别为6、12、25、50、100 mol/L。每个浓度3个复孔。培养箱孵育72 h后加入20 L CCK-8试剂,反应4
22、h后450 nm处测定光密度值。1.5 小鼠脾细胞增殖96 孔板每孔加入 100 L 脾细胞悬浮液(5 106mL-1),等细胞稳定后,ConA 组中每孔加入100 L 含有 5 g/mL ConA;药物组中每孔加入100 L含有5 g/mL ConA以及不同浓度的cytochalasin H(终浓度为3、6、12、25、30 mol/L)或者环孢菌素 A(5 mol/L)。每组 3 个重复,培养箱中孵育48 h。450 nm处测定光密度24。1.6 Western blotting检测蛋白的表达6孔板中每孔2 mL脾细胞悬浮液(1107mL-1),细胞稳定后,空白组加入 2 mL 完全培养基
23、;ConA组加入 2 mL 含 5 g/mL ConA 的完全培养基;药物组加入 2 mL 含 5 g/mL ConA 和不同浓度的cytochalasin H(终浓度为5、10、15 mol/L)或者环孢菌素A(5 mol/L),3个平行复孔。37 培养箱中培养48 h后。收集细胞提取总蛋白。然后进行Westernblotting凝胶电泳、一抗、二抗孵育,ECL试剂盒进行化学发光、显影,凝胶成像仪下测定蛋白条带25。1.7 细胞凋亡实验铺板加药处理步骤同 1.6 节,培养箱中培养48 h。收集细胞,并用PBS(pH 7.2 7.4,0.1 m无菌过滤)清洗3次,按照诺唯赞凋亡试剂盒说明书进行
24、染色,15 min后上机检测。1.8 免疫荧光实验铺板加药处理步骤同 1.6 节,培养箱中培养24 h。EP管收集,离心,清洗。加入1 mL质量分数4%的多聚甲醛固定 15 min。在 400 g 条件下离心5 min。用PBS清洗3次,每次10 min。再加1 mL体21第43卷广东海洋大学学报0 20 40 60 80 100 120 1 6 12 25 50 100 细胞存活率Cellviability/%浓度 Concentration/(mol/L)cytochalasin H 72 hCs A 72 haabbccddedeef120100806040200细胞存活率Cell vi
25、ability/%16122550100浓度Concentration/(mol/L)图1不同浓度cytochalasin H和Cs A处理对小鼠脾细胞存活率的影响Fig.1Cell survival rate after treatment with differentconcentrations of cytochalasin H and Cs A凡含一个相同字母表示同一药物处理组内差异不显著(P 0.05)。Values in the same drug treatment group with a same letter indicate nosignificant differenc
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