CytochalasinH对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca%5E%282%2B%29_CaN_NFAT信号通路的影响.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023邓小林，饶乐怡，徐静.Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响J.广东海洋大学学报,2023,43(4):19-26.收稿日期：2023-02-14基金项目：2022年度海南大学协同创新中心项目（XTCX2022STB01）；海南省重大科技项目（ZDKJ202008/ZDKJ202018）；海南省重点研发项目（ZDYF2021108）；国家自然科学基金（81973229/82160675）；广东省海洋药物重点实验室开放课题（LMM2021-4）第一作者：邓小林（1998），硕士研究生，研究方向为红树林微生物代谢产物的免疫抑制药理活性机制。E-mail:通信作者：徐静（1981），教授，研究方向为海南特有药用植物和红树林微生物天然产物化学以及药物先导化合物的开发。E-mail:Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响邓小林，饶乐怡，徐静(海南大学生态文明协同创新中心/海南大学化学工程与技术学院 海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228)摘要：【目的】研究红树林植物大红树内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48得到的次级代谢产物cytochalasin H对小鼠（Mus musculus）脾细胞的免疫抑制活性及其作用机制。【方法】用不同浓度（3、6、12、25、30 mol/L）cytochalasin H处理小鼠脾细胞，通过CCK-8活力测定法检测其对刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测cytochalasin H对小鼠脾细胞凋亡的影响；免疫荧光实验检测cytochalasin H对细胞中NFAT入核及钙离子内流的影响；酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）和免疫蛋白印迹法（Western blotting）测定cytochalasin H对脾细胞中NFAT信号通路的影响。【结果】CCK-8实验表明，cytochalasin H对于正常小鼠脾淋巴细胞的毒性比环孢菌素（Cyclosporin A，Cs A）弱，半抑制浓度IC50=（35.07 1.16）mol/L；流式细胞术显示，cytochalasin H对ConA刺激的脾淋巴细胞无促凋亡作用；cytochalasin H对ConA诱导增殖的小鼠脾淋巴细胞具有显著的抑制效果，IC50=（14.810.81）mol/L，且呈剂量依赖性；免疫荧光结果表明，cytochalasin H在浓度为15 mol/L时显著地抑制了钙离子内流；Western Blotting结果显示cytochalasin H对脾淋巴细胞中CaN、NFAT蛋白（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）的表达具有显著的抑制作用；免疫荧光结果显示，cytochalasin H抑制细胞浆内的NFAT转移到细胞核；ELISA测试结果证明，cytochalasin H能显著抑制下游细胞因子白介素-2（IL-2）的分泌（=0.05）。【结论】Cytochalasin H通过抑制Ca2+/CaN/NFAT信号通路转导显著抑制T细胞增殖和活化。关键词：cytochalasin H；T细胞增殖；细胞凋亡；Ca2+/CaN/NFAT信号通路；免疫抑制剂中图分类号：R967文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0019-08doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.003Inhibitory Effect of Cytochalasin H on the Proliferation of Mouse SpleenCells and Its Effects on Ca2+/CaN/NFAT Signaling PathwayDENG Xiao-lin,RAO Le-yi,XU Jing(Collaborative Innovation Center of Ecological Civilization,Hainan University/Hainan Provincial FineChemical Engineering Research Center,College of Chemical Engineering and Technology,HainanUniversity,Haikou 570228,China)第43卷广东海洋大学学报Abstract:【Objective】To study the immunosuppressive activity and mechanism of the secondarymetabolite cytochalasin H obtained from the endophytic fungus Phomopsis asparagi DHS-48 of themangrove plant Rhizophora mangle on mouse splenocytes.【Method】Mouse splenocytes weretreated with different concentrations of cytochalasin H(3,6,12,25,30 mol/L),and its inhibitoryeffect on Concanavalin A(ConA)-induced proliferation of mouse splenocytes was detected by CCK-8assay.The effect of cytochalasin H on the apoptosis of mouse splenocytes was detected by flowcytometry.The effect of cytochalasin H on the nuclear entry of NFAT and the influx of calcium ions incells was detected by immunofluorescence experiment.Enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA)and western blotting were used to determine the effect of cytochalasin H on NFAT signaling pathway insplenocytes.【Result】CCK-8 assay showed that cytochalasin H had a small toxic effect onlymphocytes,compared with Cyclosporin A(Cs A)(half maximal inhibitory concentration IC50=35.07 1.16 mol/L).Flow cytometry showed that cytochalasin H did not promote apoptosis of spleenlymphocytes stimulated by ConA.Cell proliferation assays showed that cytochalasin H inhibited theproliferation of ConA-induced T murine splenic lymphocyte(IC50=14.81 0.81 mol/L)in a dose-dependent manner.Immunofluorescence showed that cytochalasin H significantly inhibited calciuminflux at the concentration of 15 mol/L.Western Blotting showed that cytochalasin H significantlyinhibited the expression of nuclear factor of activated T-cells(NFAT)in spleen lymphocytes.Immunofluorescence showed that cytochalasin H inhibited the transfer of NFAT from cytoplasm tonucleus.ELISA showed that cytochalasin H decreased the secretion of the downstream cytokineinterleukin-2(IL-2)(=0.05).【Conclusion】Cytochalasin H significantly inhibits T cell proliferationby inhibiting Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway transduction.Key words:cytochalasin H;T cell proliferation;cell apoptosis;Ca2+/CaN/NFAT signaling pathway;immunosuppressant免疫抑制药物是指对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能够抑制机体发生的异常的免疫反应，临床上广泛应用于引起超敏反应性疾病、器官移植手术后的抗排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗1-4。常用的免疫抑制药物主要有环孢菌素 A（Cs A）、他克莫司（FK506）、雷帕霉素（Rapamycin）、霉酚酸脂（Mycophenolate mofetil）等，但由于上述免疫抑制剂和其他免疫抑制剂（如糖皮质激素等）具有严重的毒性，影响肾脏、神经和胃肠道系统，且很多临床上使用的免疫抑制剂的有效剂量与中毒剂量非常接近，因此开发安全有效的新型免疫抑制药物是急需的5-7。T淋巴细胞在免疫应答中起着关键作用，当其受刺激激活后，引发细胞内Ca2+浓度的改变，导致免疫细胞功能紊乱，如能够促进细胞内的转录因子从细胞质向细胞核易位，其中最典型的例子就是Ca2+/CaN/NFAT（钙离子/钙调蛋白磷酸酶/活化T细胞核因子）信号通路，当胞内Ca2+浓度增加，CaN被活化，导致NFAT去磷酸化并发生核易位，从而发挥T淋巴细胞免疫应答功能8-10。红树林内生真菌可产生许多结构独特和生物活性多样的次生代谢物，被认为是最关键和最有前途的生物活性天然产物来源之一11-12。超过50%的红树林内生真菌生物活性次生代谢物是由曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）真菌产生的，其中拟盘多毛孢属（Pestalotiopsi）、链格孢属（Alternaria）和拟茎点霉属（Phomopsis）是主要的次级代谢物生产者13。拟茎点霉属（Phomopsis）真菌具有 900 多个宿主，近年来引起了天然产物研究者的广泛关注14-15。从中分离出了多种生物活性代 谢 物 如 dicerandrols16、phomopchalasins B-C17、phompsichalasin18、cytochalasins J1-J3、cytochalasinsH1-H219和cytosporone U20等。本课题组从海南红树林大红树来源的内生真菌 Phomopsis asparagi DHS-48 中发现了化合物20第4期邓小林等：Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响cytochalasin H，化学结构鉴定为细胞松弛素H（cytochalasin H），初步发现 cytochalasin H 能够显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖21-22。但是，cytochalasinH对小鼠脾细胞生物学行为的影响和分子机制尚未见报道。因此，本研究采用CCK-8法、流式细胞术、ELISA实验、免疫荧光实验、Western blotting等，对cytochalasin H的具体作用机制进行了研究，为高效低毒免疫抑制剂的开发与利用提供了理论基础和实验依据。1 材料与方法1.1 化合物分离与纯化Cytochalasin H是本课题组前期从海南红树林大红树来源的内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48中分离纯化得到21-22。1.2 小鼠和试剂4 6周的BLAB/c小鼠，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，无特定病原体（SPF级）条件下饲养。实验前按照文献23方法制备小鼠脾细胞悬液。RPMI 1640培养基、增强型RIPA裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）、红细 胞 裂 解 液、聚 偏 二 氟 乙 烯 膜（PVDF，孔 径0.45 m）、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）、5 蛋白上样缓冲液、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.2 7.4，经0.1 m无菌滤膜过滤）均购于武汉博士德生物工程有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购于南京诺唯赞有限公司；NFAT Rabbit mAb、CaN Rabbit mAb购于CST；HRP-山羊抗兔IgG购于武汉塞维尔生物有限公司；胎牛血清购于美国 Gibco；环孢菌素 A（Cs A）、刀豆蛋白A（ConA）购于美国Sigma；Fluo-4/AM购于碧云天有限公司；小鼠白介素-2（IL-2）ELISA试剂盒购于上海抚生实业有限公司；其他常用化学试剂购于广州化学试剂厂。1.3 钙离子浓度检测实验前将试剂盒内钙离子荧光探针Fluo-4 AM分装。6孔板每孔加入1 mL制备好的脾细胞悬浮液（1 107mL-1），药物处理1 h后（药物cytochalasinH 终浓度 15 mol/L）加 ConA 处理 0.5 h，然后收集清 洗 3 遍 后，用 荧 光 探 针 Fluo-4 AM（终 浓 度0.5 mol/L）孵育30 min，然后清洗3次后，滴加适量细胞悬液在显微镜载玻片上，立即激光共聚焦显微镜下检测荧光。1.4 小鼠脾细胞毒性检测96孔板每孔加入100 L制备好的脾细胞悬浮液（1 107mL-1），放入培养箱4 h以稳定细胞。空白组：每孔加入100 L含体积分数0.2%二甲基亚砜DMSO的完全培养基；药物组：每孔加入 100 L 用 RPMI1640完全培养基稀释的不同浓度的cytochalasin H或Cs A，使药物cytochalasin H和Cs A的终浓度分别为6、12、25、50、100 mol/L。每个浓度3个复孔。培养箱孵育72 h后加入20 L CCK-8试剂，反应4 h后450 nm处测定光密度值。1.5 小鼠脾细胞增殖96 孔板每孔加入 100 L 脾细胞悬浮液（5 106mL-1），等细胞稳定后，ConA 组中每孔加入100 L 含有 5 g/mL ConA；药物组中每孔加入100 L含有5 g/mL ConA以及不同浓度的cytochalasin H（终浓度为3、6、12、25、30 mol/L）或者环孢菌素 A（5 mol/L）。每组 3 个重复，培养箱中孵育48 h。450 nm处测定光密度24。1.6 Western blotting检测蛋白的表达6孔板中每孔2 mL脾细胞悬浮液（1107mL-1），细胞稳定后，空白组加入 2 mL 完全培养基；ConA组加入 2 mL 含 5 g/mL ConA 的完全培养基；药物组加入 2 mL 含 5 g/mL ConA 和不同浓度的cytochalasin H（终浓度为5、10、15 mol/L）或者环孢菌素A（5 mol/L），3个平行复孔。37 培养箱中培养48 h后。收集细胞提取总蛋白。然后进行Westernblotting凝胶电泳、一抗、二抗孵育，ECL试剂盒进行化学发光、显影，凝胶成像仪下测定蛋白条带25。1.7 细胞凋亡实验铺板加药处理步骤同 1.6 节，培养箱中培养48 h。收集细胞，并用PBS（pH 7.2 7.4，0.1 m无菌过滤）清洗3次，按照诺唯赞凋亡试剂盒说明书进行染色，15 min后上机检测。1.8 免疫荧光实验铺板加药处理步骤同 1.6 节，培养箱中培养24 h。EP管收集，离心，清洗。加入1 mL质量分数4%的多聚甲醛固定 15 min。在 400 g 条件下离心5 min。用PBS清洗3次，每次10 min。再加1 mL体21第43卷广东海洋大学学报0 20 40 60 80 100 120 1 6 12 25 50 100 细胞存活率Cellviability/%浓度 Concentration/(mol/L）cytochalasin H 72 hCs A 72 haabbccddedeef120100806040200细胞存活率Cell viability/%16122550100浓度Concentration/(mol/L)图1不同浓度cytochalasin H和Cs A处理对小鼠脾细胞存活率的影响Fig.1Cell survival rate after treatment with differentconcentrations of cytochalasin H and Cs A凡含一个相同字母表示同一药物处理组内差异不显著（P 0.05）。Values in the same drug treatment group with a same letter indicate nosignificant difference(P 0.05).积分数0.1%的Triton X-100室温放置15 min，来通透细胞膜。离心，清洗3遍。然后进行BSA封闭、NFAT一抗、二抗避光室温孵育、DAPI核染液，避光室温染色 5 min。最后一遍清洗时剩余约 100 L，将细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片，共聚焦显微镜观察拍照。1.9 白介素-2(IL-2)含量检测铺板加药处理步骤同 1.6 节，培养箱中培养24 h。按照上海抚生提供的ELISA试剂盒中说明书步骤进行白介素-2 含量测定，加终止液后 15 min内，用酶标仪测试 450 nm 波长下每个样品的光密度值。1.10 数据分析每个实验至少重复3次，且均为独立实验，使用Excel对不符合正态分布的存活率数据进行反正弦转换，选用 LSD 法进行组间显著性分析，使用GraphPad Prism 9 对所得数据进行单因素均值比较（ANOVA）。所有结果均以平均值 标准差（Mean SD）表示。差异显著水平=0.05。2 结果与分析2.1 Cytochalasin H对小鼠脾细胞毒性的影响从图1可知，135 mol/L浓度范围内cytochalasin H对脾细胞的毒性较弱。其对正常小鼠脾细胞的细胞毒性半抑制浓度IC50=（35.07 1.16）mol/L，而环孢菌素（Cs A）则严重影响小鼠脾细胞的存活率，IC50=（10.86 0.78）mol/L，所以与环孢菌素（Cs A）相比，cytochalasin H 对小鼠脾细胞的毒性较低。2.2Cytochalasin H 对 Con A 诱导的脾淋巴细胞的抑制效果如图 2 所示，cytochalasin H 对 ConA 诱导增殖的小鼠脾淋巴细胞具较好的抑制效果，加入的ConA 会诱导小鼠脾淋巴细胞中的T淋巴细胞增殖，加入 cytochalasin H，随着化合物浓度升高，细胞存活率越小，表现出浓度依赖性。当药物浓度分别为3、6、12、25、30 mol/L时，ConA诱导的增殖T淋巴细 胞 的 存 活 率 分 别 为 83.12%、69.53%、56.31%、40.87%、29.67%，而用 5 mol/L 的环孢菌素（Cs A）处理的细胞存活率为 33.21%。Cytochalasin H 对ConA诱导的脾淋巴细胞半抑制浓度IC50=（14.81 0.21）mol/L。2.4 Cytochalasin H对细胞凋亡的影响如图3所示，小鼠脾细胞由ConA诱导后，小鼠脾细胞迅速增加且无凋亡，经不同浓度cytochalasinH处理后，细胞凋亡百分比并未增加，即加药组凋亡百分率与ConA组比较并无显著差异（P 0.05），所以cytochalasin H处理并不会促使ConA诱导的小鼠脾细胞凋亡。2.5 Cytochalasin H对钙离子内流的影响结果如图4所示，通过激光共聚焦显微镜检测Fluo 4-AM染色后的细胞内钙离子浓度，结果显示，通过观察细胞内荧光强度得出，ConA组的荧光强度与空白组相比，显著增强，说明ConA刺激的细胞内 Ca2+浓度升高；而用 15 mol/L 的 cytochalasin H处理后，能减弱荧光强度，说明cytochalasin H处理的细胞内Ca2+浓度降低。Ca2+是细胞内的一种典型信号离子，其中与免疫抑制相关的一条通路即是通过CaN-NFAT途径来调节。图2不同浓度cytochalasin H处理后对ConA诱导的脾细胞增殖的抑制作用Fig.2Inhibitory effect of different concentrations of cytochalasinH on ConA-induced proliferation of splenocytes与ConA组比较，*表示结果非常有显著统计学差异（P 0.01）。Compared with the ConA group,*indicates very significant statisticaldifference in results(P 0.01).cytochalasin H浓度cytochalasin H Concentration/(mol/L)36122530ConA组CsA-5组*120100806040200细胞存活率Cell viability/%22第4期邓小林等：Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响碘化丙啶PI染料染色下的荧光强度Controlcytochalasin H(5 mol/L)cytochalasin H(10 mol/L)cytochalasin H(15 mol/L)ConA(5 g/mL)膜联蛋白V染料染色下的荧光强度10710610510410310210110410510610701041051061070104105106107010410510610701041051061070Q14.20Q28.49Q480.3Q37.01Q10.96Q21.11Q495.3Q32.61Q12.51Q23.24Q492.2Q32.04Q12.50Q22.84Q492.4Q32.25Q12.90Q22.63Q492.9Q32.39空白controlConA组51015cytochalasinH浓度cytochalasinHconcentration/(mol/L)181614121086420#凋亡百分比Apoptosis percentage/%图3Cytochalasin H对ConA诱导的脾细胞凋亡的影响Fig.3Effect of cytochalasin H on spleen cell apoptosis induced by ConAQ4，活细胞Annexin V-/PI-；Q3，早期凋亡细胞Annexin V+/PI-；Q2，晚期凋亡细胞Annexin V+/PI+；Q1，坏死细胞Annexin V-/PI+；凋亡百分比为早期凋亡百分比加晚期凋亡百分比；早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞比例总和数据以平均值 标准差表示；与Control组比较，#，P 0.01。Q4:live cells(Annexin V-/PI-);Q3:early apoptotic cells(Annexin V+/PI-);Q2:late apoptotic cells(Annexin V+/PI+);Q1:necrotic cells(Annexin V-/PI+);The percentage of apoptosis is the percentage of early apoptosis plus the percentage of late apoptosis;The sum of the proportion of early apoptoticcells(Q3)and late apoptotic cells(Q2)is expressed as mean SD.Compared with control group,#,P 0.01.cytochalasin H(15 mol/L)ConA(5 g/mL)ControlCsA(5 mol/L)#*6005004003002001000荧光强度Flurescence intensity*ABCD组别Groups图4Cytochalasin H对ConA诱导的脾细胞内Ca2+浓度的影响Fig.4Effect of cytochalasin H on intracellular Ca2+concentration induced by ConAA-D分别表示空白组、ConA组、15mol/LcytochalasinH组、5mol/LCsA组；与Control组比较，#，P 0.01；与ConA组比较，*，P 0.05，*，P 0.01。A-D represent control group,ConA group，15 mol/L cytochalasin H and 5 mol/L CsA group;Compared with control group,#,P 0.01;Comparedwith ConA group,*,P 0.05,*,P 0.01.2.6Cytochalasin H对细胞中 CaN、NFAT蛋白表达的抑制作用从图 5 和图 6 WB 条带可得出，小鼠脾细胞由Con A诱导后，CaN、NFAT蛋白表达均增加。而不同浓度 cytochalasin H 或环孢菌素（Cs A）处理后，CaN、NFAT蛋白表达减少，且表现出浓度依赖性，结合图4，说明化合物cytochalasin H通过抑制钙离子内流抑制了下游CaN蛋白的表达，以此抑制NFAT信号通路中NFAT蛋白的表达。2.7 cytochalasin H对NFAT通路的影响图7所示，使用免疫荧光法检测cytochalasin H对NFAT通路作用的实验发现，空白组NFAT蛋白主要存在于细胞浆内，ConA诱导后，大量的NFAT蛋白从细胞浆转移到了细胞核中。经过 cytochalasinH处理后，转移至细胞核内的NFAT蛋白明显减少。上述结果说明，cytochalasin H是一种潜在的可以抑0m750m750m750m7523第43卷广东海洋大学学报制细胞内Ca2+内流从而抑制下游CaN/NFAT信号通路的免疫抑制剂。2.8 Cytochalasin H对细胞白介素-2（IL-2）表达含量的影响在小鼠脾淋巴细胞由 ConA 诱导增殖后，IL-2的分泌量迅速升高，经不同浓度的cytochalasin H或环孢菌素（Cs A）处理后，IL-2的分泌明显降低，且呈浓度依赖性效果(图8)。所以cytochalasin H在降低NFAT表达后，随后能够抑制细胞中IL-2的分泌，以此发挥免疫抑制作用。图5Cytochalasin H对ConA诱导的脾细胞内CaN蛋白表达的影响Fig.5Effect of cytochalasin on the the expression of CaNprotein in splenocytes induced by ConA-表示不添加；+表示添加；与Control组比较，#，P 0.01；与ConA组比较，*，P 0.01。-means not to add;+means to add;Compared with control group,#,P 0.01;Compared with ConA group,*,P 0.01.-51015-CsA(mol/L)cytochalasin H(mol/L)ConA(5 g/mL)-5-+CaN-Actin空白controlConA组51015cytochalasinH浓度cytochalasinHconcentration/(mol/L)1.21.00.80.60.40.20.0#CsA-5组*蛋白相对表达量Relative expression of protein(CaN/-Actin)图6Cytochalasin H对ConA诱导的脾细胞中NFAT表达的影响Fig.6Effect of cytochalasin H on the expression of NFAT insplenocytes induced by ConA-表示不添加；+表示添加；与Control组比较，#，P 0.01；与ConA组比较，*，P 0.01。-means not to add;+means to add;Compared with control group,#,P 0.01;Compared with ConA group,*,P 0.01.-51015-5-+CsA(mol/L)cytochalasin H(mol/L)ConA(5 g/mL)NFAT-Actin#*1.41.21.00.80.60.40.20.0蛋白相对表达量Relative expression of protein(NFAT/-Actin)空白controlConA组51015cytochalasinH浓度cytochalasinHconcentration/(mol/L)CsA-5组图7Cytochalasin H对NFAT蛋白核移位的影响Fig.7Effect of cytochalasin H on nuclear translocation of NFAT proteinDAPI细胞核染色为蓝色荧光，NFAT蛋白为绿色荧光。显微镜倍数200。Nucleus stained with DAPI is blue fluorescence,NFAT protein is green fluorescence.Microscope magnification:200.Cytochalasin H(15 mol/L)+Con ACon AControl目的蛋白NFAT细胞核Nucleus目的蛋白与细胞核混合Merge24第4期邓小林等：Cytochalasin H对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca2+/CaN/NFAT信号通路的影响3 讨论在自身免疫性疾病中，免疫细胞无法区分自身结构和非自身结构的能力，导致免疫系统出现包括T淋巴细胞的增殖、激活和相关细胞因子分泌的增强等的过度反应26-27。现有的药物Cs A和FK506疗效有限且具副作用，目前治疗自身免疫性疾病的新药物的开发需求很高，所以从天然产物中开发免疫抑制先导物是一种有效途径28。实验室在前期研究中已发现许多能直接抑制钙调蛋白磷酸酶（CaN）的抑制剂，如 phaseolorin J22、16-O-deacetylhelvolicacid 21,16-lactone7、efophylins B23、吐叶醇3和细胞松弛素类化合物phomopchalasin E21，均能通过直接抑制CaN活性而不需要通过辅助蛋白（如FKBP）产生免疫抑制效果。其中phomopchalasin E对小鼠脾细胞毒性极小IC50=（111.70 1.10）mol/L，体外显著抑制CaN酶活性IC50=（17.89 0.40）mol/L，且具有极佳的抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖作用IC50=（21.60 1.70）mol/L，可以抑制ConA刺激的NFAT去磷酸化，并阻断NFAT易位，随后抑制IL-2的转录，通过抑制CN/NFAT信号通路抑制ConA刺激的脾淋巴细胞的活化21。另一细胞松弛素类化合物chaetoglobosin F，具有抗肿瘤活性、植物毒性且具有免疫抑制特性29。Chaetoglobosin F在非细胞毒性浓度内通过多种信号通路抑制CpG寡核苷酸诱导的小鼠骨髓来源的树突状细胞（BM-DCs）的成熟和功能，并抑制DCs的TLR9（Toll样受体9）表达。此外，它还抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活以及核因子-B（NF-B）和信号转导与转录激活因子 1（STAT1）的核转位，在控制DCs相关的自身免疫或炎症性疾病方面可能具有很大的应用潜力30。而本研究结果与上述细胞松弛素不同，本研究中 cytochalasin H 是通过抑制 ConA 刺激的脾淋巴细胞中钙离子的内流，以抑制CaN蛋白的表达，从而降低NFAT蛋白的表达水平，阻止其进入细胞核，从而阻止下游细胞因子 IL-2 的分泌，以发挥免疫抑制作用。Ca2+作为T细胞内重要的第二信使，可以充当传感器接受胞外分子刺激，将胞外信号转换为胞内信号，Ca2+信号在T细胞活化和增殖中起着关键作用31-32。当T细胞受体受刺激会介导Ca2+流入，Ca2+浓度上升启动T细胞内免疫反应，而Ca2+参与T细胞的免疫反应，主要通过诱导Ca2+/CaN/NFAT通路来控制细胞因子的转录和分泌（如IL-2），因此降低Ca2+浓度以抑制 CaN/NFAT 通路活化，是实现免疫抑制作用是一种有效的途径33-34。Cytochalasin H是从海南大红树内生真菌DHS-48发酵产物中分离得到，已有文献报道了其神经保护活性35。本研究初步探讨了cytochalasin H在小鼠脾淋巴细胞中具体的免疫抑制机制，发现cytochalasin H通过阻断Ca2+/CaN/NFAT信号通路转导来发挥免疫抑制作用，是一种潜在的免疫抑制先导物，这为开发和研究高效低毒的免疫抑制剂提供了理论基础。参考文献1 WANG L F,WANG F S,GERSHWIN M E.Human autoimmunediseases:a comprehensive updateJ.Journal of InternalMedicine,2015,278(4):369-395.2 EATON W W,ROSE N R,KALAYDJIAN A,et al.Epidemiology of autoimmune diseases in DenmarkJ.Journal ofAutoimmunity,2007,29(1):1-9.3 XUEXIA ZHANG,LI G,DENG Q,et al.Vomifoliol isolatedfrom mangrove plant Ceriops tagal inhibits the NFAT signalingpathway with CN as the target enzyme in vitroJ.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2021,48:128235.4 WISEMAN A C.Immunosuppressive medicationsJ.ClinicalJournal of the American Society of Nephrology,2016,11(2):332-343.5 熊瑛.杜鹃素对小鼠T细胞免疫抑制作用的研究D.长春:吉林大学,2014.6 宋博翠.瑞香素对小鼠淋巴细胞免疫抑制效果及其作用机制的研究D.长春:吉林大学,2014.7 周俐斐,赵家文,侯桂兰