EZH2基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制.pdf
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1、基础研究 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制陈茜,王海燕,刘宪,刘佳(西安交通大学第一附属医院 生殖医学科,陕西 西安 ;陕西省肿瘤医院 胸外科,陕西 西安 )摘要目的探讨 在宫颈癌中对顺铂耐药的作用及机制。方法将宫颈癌细胞分为对照组 干扰 ()组、对照组 过表达 组、对照组 处理组及对照组 顺铂()耐药组,采用 法检测细胞耐药性,实时荧光定量 检测 、表达水平,蛋白印迹法检测 、蛋白表达情况。结果与对照组比较,干扰 组顺铂 降低,细胞抑制率升高,和蛋白表达降低;过表达 组顺铂 升高,细胞抑制率降低,和蛋白表达升高;处理组顺铂 降低,细胞抑制率升高;与对照组比较,顺铂耐药组 、的 和蛋白表达升
2、高,差异均有统计学意义()。结论 诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药,其机制可能与调控细胞耐药相关基因 的表达有关。关键词宫颈肿瘤;基因;顺铂;耐药性;蛋白表达 中图分类号 文献标识码 文章编号 ():,(,;,)(),(),(),;第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金 ;陕西省肿瘤医院院基金()通信作者 :引用本文:陈茜,王海燕,刘宪,等 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制 贵州医科大学学报,():,宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,近年来其发病有年轻化的趋势,严重威胁女性健康 。目前,对宫颈癌仍采用以手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方法,其中化疗主要用于晚期
3、或复发转移的患者。近年也采用手术联合术前新辅助化疗可缩小肿瘤病灶及控制亚临床转移、亦可用于放疗增敏,顺铂为常用化疗药物之一 。宫颈癌细胞对化疗药物产生的耐药性会严重地影响化疗药物的治疗效果。因此,探讨预测宫颈癌化疗敏感性的生物学指标,增强化疗药物敏感性,寻求逆转化疗耐药的新方法及靶向治疗为宫颈癌化疗耐药的处理提供新的思路。是多梳家族蛋白(,)的重要组分,被认为与多种癌症类型有关,其突变、扩增和、或过表达与癌症进展和不良预后密切相关 。有研究表明 的高表达导致肿瘤细胞耐药,如在乳腺癌中 过表达降低了肿瘤细胞对他莫西芬的药物敏感性 ,靶向作用于 可能成为解决癌治疗化疗耐药的一个新策略。关于 在宫颈
4、癌化疗耐药中的作用和机制研究较少,本研究通过在宫颈癌细胞中抑制或过表达 基因,观察其对宫颈癌细胞顺铂耐药功能的影响及可能机制,为宫颈癌的化疗耐药问题提供理论支持,增强化疗药物敏感性,报告如下。材料与方法 材料 细胞来源人宫颈癌细胞系 、购于美国 细胞库。主要试剂与仪器 高糖培养基(美国 ),胎牛血清(美国 ),青霉素、链霉素、(美国 ),顺铂(山东齐鲁制药),(上海 ,工作浓度 ),(美国 ),质粒及其 质粒(上海吉玛制药技术公司),兔抗人 单克隆抗体(美国 ),鼠抗人单克隆抗体 和 (美国 ),二氧化碳培养箱(德国 ),光学倒置显微镜(日本 ),酶标仪(美国 )。方法 细胞转染及分组按照 转
5、染说明书将构建的 真核表达质粒和对照转染至 细胞、和对照转染至 和 细胞,筛选稳定的阳性克隆细胞,用 鉴定作为实验的工具细胞 。宫颈癌细胞对肿瘤药物顺铂的耐药性将处于对数生长期过表达或干扰 的细胞通过胰酶消化后,制成单细胞悬液,按照 (或 )的细胞浓度接种于 孔细胞培养板中,每孔加入 的培养基,待细胞贴壁后、更换为含有不同浓度包括 、(或 )顺铂的培养基进行培养,培养 (或 、)后,吸弃各孔内的培养基,分别加入 (),孵育 后吸弃各孔中的上清液,分别加入 (),于摇床震荡 后,用酶标仪测定 波长处每孔的光密度值(),每组均设置 个复孔。宫颈癌细胞系 、顺铂耐药细胞株 和 建立将处于对数生长期的
6、 ()细胞通过胰酶消化后接种于 培养皿中,细胞密度生长至 时,加入 顺铂持续处理 时、分别于 、(细胞 、)的顺铂中培养 周,获得稳定生长且对顺铂耐药的细胞株分别命名为 和 细胞,以终浓度为 (细胞 )顺铂中长期培养,以维持细胞的耐药性。实时荧光定量 ()法提取细胞中的总 、并反转录,反转录条件为 、,以反转录产物为模板进行实时荧光定量 ,为内参。引物序列:为 ,为 ,为 ,为 ,为 ,为 。按照 说明书操作,反应条件为 (),(),(),实验重复 次。分析从细胞中提取蛋白,以 蛋白定量法测定蛋白质浓度。蛋白经 电 泳,应 用 湿 转 法 转 移 到 膜,脱脂牛奶封闭,加入 脱脂牛奶稀释的一抗
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