EZH2基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制.pdf

基础研究 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制陈茜，王海燕，刘宪，刘佳（西安交通大学第一附属医院 生殖医学科，陕西 西安 ；陕西省肿瘤医院 胸外科，陕西 西安 ）摘要目的探讨 在宫颈癌中对顺铂耐药的作用及机制。方法将宫颈癌细胞分为对照组 干扰 （）组、对照组 过表达 组、对照组 处理组及对照组 顺铂（）耐药组，采用 法检测细胞耐药性，实时荧光定量 检测 、表达水平，蛋白印迹法检测 、蛋白表达情况。结果与对照组比较，干扰 组顺铂 降低，细胞抑制率升高，和蛋白表达降低；过表达 组顺铂 升高，细胞抑制率降低，和蛋白表达升高；处理组顺铂 降低，细胞抑制率升高；与对照组比较，顺铂耐药组 、的 和蛋白表达升高，差异均有统计学意义（）。结论 诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药，其机制可能与调控细胞耐药相关基因 的表达有关。关键词宫颈肿瘤；基因；顺铂；耐药性；蛋白表达 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，）（），（），（），；第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金 ；陕西省肿瘤医院院基金（）通信作者 ：引用本文：陈茜，王海燕，刘宪，等 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制 贵州医科大学学报，（）：，宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，近年来其发病有年轻化的趋势，严重威胁女性健康 。目前，对宫颈癌仍采用以手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方法，其中化疗主要用于晚期或复发转移的患者。近年也采用手术联合术前新辅助化疗可缩小肿瘤病灶及控制亚临床转移、亦可用于放疗增敏，顺铂为常用化疗药物之一 。宫颈癌细胞对化疗药物产生的耐药性会严重地影响化疗药物的治疗效果。因此，探讨预测宫颈癌化疗敏感性的生物学指标，增强化疗药物敏感性，寻求逆转化疗耐药的新方法及靶向治疗为宫颈癌化疗耐药的处理提供新的思路。是多梳家族蛋白（，）的重要组分，被认为与多种癌症类型有关，其突变、扩增和、或过表达与癌症进展和不良预后密切相关 。有研究表明 的高表达导致肿瘤细胞耐药，如在乳腺癌中 过表达降低了肿瘤细胞对他莫西芬的药物敏感性 ，靶向作用于 可能成为解决癌治疗化疗耐药的一个新策略。关于 在宫颈癌化疗耐药中的作用和机制研究较少，本研究通过在宫颈癌细胞中抑制或过表达 基因，观察其对宫颈癌细胞顺铂耐药功能的影响及可能机制，为宫颈癌的化疗耐药问题提供理论支持，增强化疗药物敏感性，报告如下。材料与方法 材料 细胞来源人宫颈癌细胞系 、购于美国 细胞库。主要试剂与仪器 高糖培养基（美国 ），胎牛血清（美国 ），青霉素、链霉素、（美国 ），顺铂（山东齐鲁制药），（上海 ，工作浓度 ），（美国 ），质粒及其 质粒（上海吉玛制药技术公司），兔抗人 单克隆抗体（美国 ），鼠抗人单克隆抗体 和 （美国 ），二氧化碳培养箱（德国 ），光学倒置显微镜（日本 ），酶标仪（美国 ）。方法 细胞转染及分组按照 转染说明书将构建的 真核表达质粒和对照转染至 细胞、和对照转染至 和 细胞，筛选稳定的阳性克隆细胞，用 鉴定作为实验的工具细胞 。宫颈癌细胞对肿瘤药物顺铂的耐药性将处于对数生长期过表达或干扰 的细胞通过胰酶消化后，制成单细胞悬液，按照 （或 ）的细胞浓度接种于 孔细胞培养板中，每孔加入 的培养基，待细胞贴壁后、更换为含有不同浓度包括 、（或 ）顺铂的培养基进行培养，培养 （或 、）后，吸弃各孔内的培养基，分别加入 （），孵育 后吸弃各孔中的上清液，分别加入 （），于摇床震荡 后，用酶标仪测定 波长处每孔的光密度值（），每组均设置 个复孔。宫颈癌细胞系 、顺铂耐药细胞株 和 建立将处于对数生长期的 （）细胞通过胰酶消化后接种于 培养皿中，细胞密度生长至 时，加入 顺铂持续处理 时、分别于 、（细胞 、）的顺铂中培养 周，获得稳定生长且对顺铂耐药的细胞株分别命名为 和 细胞，以终浓度为 （细胞 ）顺铂中长期培养，以维持细胞的耐药性。实时荧光定量 （）法提取细胞中的总 、并反转录，反转录条件为 、，以反转录产物为模板进行实时荧光定量 ，为内参。引物序列：为 ，为 ，为 ，为 ，为 ，为 。按照 说明书操作，反应条件为 （），（），（），实验重复 次。分析从细胞中提取蛋白，以 蛋白定量法测定蛋白质浓度。蛋白经 电 泳，应 用 湿 转 法 转 移 到 膜，脱脂牛奶封闭，加入 脱脂牛奶稀释的一抗（稀释的兔抗人 、鼠抗人 和鼠抗人 抗体）在 孵育过夜，期陈茜等 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制与相应的 稀释的二抗在室温孵育，加 发光剂，用 化学发光成像系统一体机进行曝光，采用 软件进行吸光度分析。统计学分析所有资料应用 软件处理和分析，实验数据以均数 标准差（）表示，两组间比较采用独立样本 检验；认为差异有统计学意义。结果 对顺铂 的影响抑制 蛋白表达后，在 与 细胞中顺铂的 低于对照组；细胞中过表达 后，高于对照组，差异有统计学意义（）。见图 。注：为 细胞活力所占百分比，为 细胞活力所占百分比，为 细胞活力所占百分比；（）与对照组比较，。图 对宫颈癌细胞顺铂 的影响（法）（）对宫颈癌细胞增殖率的影响 顺铂处理 后，组细胞活力率低于对照组；处理 后，组细胞活力率低于对照组；而处理 后，组细胞活力率高于对照组，差异有统计学意义（）。见图 。抑制剂 增强过表达细胞对顺铂的敏感性 组顺铂 低于对照组，差异有统计学意义（）；顺铂处理 后，组细胞活力率低于 组。见图 。提示 是一种有效的、选择性 抑制剂。和 的表达 结 果 显 示，与 对 照 组 比 较，抑 制 表达后，的 水平降低；过表达后其 水平升高；在 和 中 的 表达均高于对照组；在 和 中 的 表达也高于对照组，差异有统计学意义（）。见图 。和 蛋白的表达 结果显示，与对照组比较，抑制 表达后，的蛋白水平降低；过表达后其蛋白水平升高；在 和 中 和 的蛋白表达均高于对照组，差异有统计学意义（）。见图 。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：为 细胞增殖率，为 细胞增殖率，为 细胞增殖率；（）与对照组比较，。图 对宫颈癌细胞增殖率的影响（）（）注：为 细胞活力所占百分比，为 细胞增殖率；（）与对照组比较，。图 抑制剂 增强过表达细胞对顺铂的敏感性 讨论宫颈癌是次于肺癌、乳腺癌的第三大女性常见恶性肿瘤，早期以手术治疗为主，有高危因素者术后需补充放化疗；中晚期患者以同步放化疗为主。对于复发性、转移性、难治性宫颈癌患者，化疗是常用的姑息治疗手段，因此化疗在宫颈癌的治疗中越来越重要，然而随着肿瘤化疗耐药性的产生，耐药已经成为导致化疗失败、疾病复发的主要原因。探讨预测宫颈癌化疗敏感性的生物学指标，增强化疗药物敏感性，逆转化疗耐药及靶向治疗将为宫颈癌化疗耐药的治疗提供新的前景 。研究表明，肿瘤细胞系中 扩增可导致细胞增殖、迁移和血管生成，并导致肿瘤进展。虽然不同肿瘤中 的作用方式及机制不同，但是该基因存在往往预示着癌症预后不佳 。作用于抗肿瘤药物敏感基因，可导致肿瘤细胞耐药。在小细胞肺癌中，轴促进了小细胞肺癌的化疗耐药，应用 抑制剂 联合化疗能够一定程度上克服耐药，从而提高患者受益 。在肝细胞癌，调节轴期陈茜等 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制注：为改变 细胞表达的宫颈癌细胞中 水平，为 和 中 和 水平，为内参；与对照组比较，（），（）。图 和 的表达（）（）注：、为改变 细胞表达的宫颈癌细胞中 蛋白水平，、为 和 中 和 蛋白水平；（）与对照组比较，。图 和 蛋白的表达（）（）贵 州 医 科 大 学 学 报 卷可能通过改变患者体内 的变化，改变 的表达，从而介导索拉非尼耐药。应用 抑制剂可显著逆转 诱导的索拉非尼耐药 。顺铂，是一种含铂的细胞非特异性抗癌药物，能与 结合，引起交叉联结，从而破坏 的功能，并抑制细胞有丝分裂 。本研究结果表明，抑制 表达增强宫颈癌细胞对顺铂敏感性而降低其耐药性，表现为顺铂的 降低，细胞增殖抑制率显著增加。应用 抑制剂 于过表达 细胞，能够提升细胞对顺铂的敏感性。结果说明 基因参与宫颈癌对顺铂的耐药。为阐明 影响宫颈癌对顺铂耐药的分子机制，接着建立对顺铂耐药的 、细胞耐药细胞株 和 ，进一步分析效应分子变化。是 转运体家族耐药蛋白之一，其功能是将大部可能分的化疗药泵出细胞外，导致细胞内化疗药物浓度降低，参与肿瘤细胞的多药耐药性 。研究发现 与结直肠癌 、乳腺癌 耐药密切相关。本研究结果显示，抑制 后，的 和蛋白表达水平明显降低；过表达后明显升高。和 中 、的 和蛋白表达水平均明显升高，说明 可能通过调控细胞耐药基因 诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药。综上所述，基因可能通过调节细胞耐药基因 的表达而调控着顺铂对宫颈癌化疗的敏感性。而作用的具体机制仍有待于进一步研究，有望成为宫颈癌化疗耐药的作用靶点。参考文献 ，（）：，：，（）：王黎明，汪辉宫颈癌化疗策略及进展 中国实用妇科与产科杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（下转第 页）期陈茜等 基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制 ，（）：胡可，张炳东大鼠星状神经节阻滞方法的综述 中国比较医学杂志，（）：，（）：侯秦汉，刘全，付锦龙，等醉茄素 对小鼠脊髓损伤的抗炎和神经保护作用研究 广西医科大学学报，（）：苑龙，李雪松，孟纯阳，等炎症与神经病理性疼痛关系的研究进展 中国医师杂志，（）：，：赵梦滢，朱钰文，黄立丹，等 肿瘤坏死因子 与脊髓损伤的研究进展 神经损伤与功能重建，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，：，：郭辉，徐惠青星状神经节阻滞联合针刺夹脊穴对急性期带状疱疹疼痛及炎症反应的影响 世界中西医结合杂志，（）：，（）：，：，（）：李耀民，李兴志 星状神经节阻滞治疗疼痛临床应用进展 中国疼痛医学杂志，（）：（收稿，修回）中文编辑刘平英文编辑丁廷森（上接第 页），：，（）：，（），（）：，（）：（收稿，修回）中文编辑刘平英文编辑丁廷森贵 州 医 科 大 学 学 报 卷