伴G6PD基因变异狼疮性肾炎患者的临床特点及基因变异分析.pdf
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1、第32 卷第3期2023年6 月肾脏病与透析肾移植杂志207伴 G6PD基因变异狼疮性肾炎患者的临床特点及基因变异分析金英*罗晓鑫*梁丹丹!彭嘉惠?张洋洋1涂远茂刘志红2张昌明!摘要目的:分析3例携带葡萄糖6 磷酸脱氢酶(G6PD)基因变异的狼疮性肾炎(LN)患者的临床及病理特点,讨论G6PD基因变异检测在系统性红斑狼疮(SLE)中的临床价值。方法:收集3例患者的临床病理资料。采用全外显子测序检测LN患者的G6PD基因变异,Sanger测序检测亲属G6PD基因变异情况。G6PD/6磷酸葡萄糖脱氢酶(6 PGD)比值法测定G6PD酶活性。定量聚合酶链反应(qPCR)和细胞因子微球检测技术(CBA
2、)检测其中2 例患者的炎症状态特征。结果:3例患者均曾有血三系减低,Coombs试验均阴性,红细胞碎片均阳性,G6PD酶活性均缺乏。2 例男性患者为G6PD c.G1466T(p.R489L)半合子变异,均遗传自母亲;1例女性患者为C6PD c.G1466T(p.R489L)及c.G1478A(p.R493H)复合杂合变异,分别遗传自父母双方。qPCR及CBA检测发现,与正常对照相比,2 例患者血细胞干扰素刺激基因IFIT1、IFI44L、O A S1与MX2表达明显升高,血清白细胞介素8(IL-8)及干扰素诱导蛋白10(IP-10)明显升高,提示型干扰素信号通路的过度激活及炎性细胞因子的过度
3、产生。结论:合并G6PD基因变异的LN患者常以贫血为首发或突出临床表现,伴I型干扰素信号通路的过度激活以及炎性细胞因子的过度产生,其在SLE发病中的作用值得进一步研究。关键词葡萄糖6 磷酸脱氢酶系统性红斑狼疮狼疮性肾炎溶血性贫血Clinicopathological and genetic features of lupus nephritis patients with G6PD variantsJIN Ying*,LUO Xiaoxin?*,LIANG Dandan,PENG Jiahui,ZHANG Yangyang,TU Yuanmao,LIU Zhihong.1,2ZHANG Cha
4、ngmingNational Clinical Research Center of Kidney Diseases,Jinling Hospital,Nanjing Medical University,Nanjing 210016,China2 Zhejang University School of Medicine,Hangzhou 310058,ChinaIINJIN Ying and LUO Xiaoxin are considered to be first authorsCorresponding author:ZHANG Changming(E-mail:zhangchmin
5、gg )ABSTRACT Objective:To summarize the clinical and pathological characteristics of 3 patients with lupus nephritiswho carried the missense variants of glucose 6-phosphate dehydrogenase(G6PD)and to discuss the clinical value of G6PDvariants detection in systemic lupus erythematosus.JMethodology:We
6、collected the clinical and pathological data of 3patients with lupus nephritis in Jinling Hospital.Pathogenic variants was screened by whole-exome sequencing(WES)inthe patients and validated by Sanger sequencing in family members.G6PD/6PGD ratio method was used to test the G6PDenzyme activity.Quanti
7、tative polymerase chain reaction(q PCR)a n d c y t o me t r i c b e a d a r r a y (CBA)w a s u s e d t o d e t e c tinflammatory signatures in two patients.Results:All the 3 patients had a history of pancytopenia.Coombs tests werenegative,but the red blood cell fragments were all positive.WES identi
8、fied two kinds of variants in G6PD gene.Two malesD0I:10.3969/j.issn.1006-298X.2023.03.002【基金项目】国家自然科学基金(8 2 17 0 7 39);江苏省科技资源统筹服务平台肾脏疾病样本库运行经费(BM2015004-1);江苏省重大疾病生物资源样本库开放课题(JSRB2021-02)【作者单位】南京医科大学金陵临床医学院(东部战区总医院)博士研究生(金英)国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所(南京,2 10 0 16);2 浙江大学医学院;*金英和罗晓鑫为共同第一作者通信作者张昌明(E-mail
9、:z h a n g c h m i n g g h o t m a i l.c o m)本文版权归肾脏病与透析肾移植杂志编辑部所有Vol.32No.3Jun.2023JNephrolDialyTransplant208had a hemizygous variant of c.G1466T(p.R489L)inherited from their mother,while the female patient had a compoundheterozygous variant of c.G1466T(p.R489L)and c.G1478A(p.R493H)inherited from t
10、he parents.The G6PD enzymeactivity were all deficient.We further identified hyperactivation signatures of type I interferon signaling and overproductionof pro-inflammatory cytokines in the blood of two patients.Compared with the normal controls,the expression of in terferon-stimulated genes IFIT1,IF
11、I44L,OAS1 and MX2 in blood cells of two patients was significantly higher,as well as theserum IL-8 and IP-10 levels.Conclusion:Lupus nephritis patients with G6PD gene variants may present with anemia asthe first or prominent clinical manifestation,accompanied by excessive activation of type I interf
12、eron signal pathway andexcessive production of inflammatory cytokines in the blood.Its role in the pathogenesis of SLE deserves further study.Key words glucose 6-phosphate dehydrogenase variantssystemic lupus erythematosuslupus nephritishemolyticanemia研究发现同卵双胞胎的系统性红斑狼疮(SLE)同病率为2 4%35%,而异卵双胞胎的SLE同病率仅
13、2%5%,提示基因背景与环境因素在SLE发病中共同作用。SLE具有明显的家族聚集倾向,GLADEL队列117 7 例SLE患者中有16 6 例(14.1%)患者的2 38 例亲属患自身免疫性疾病,其中116 例患SLE2。全基因组关联分析研究发现的SLE易感基因功能主要涉及自身抗原识别、先天免疫系统激活及适应性免疫系统功能障碍等。本文收集了3例携带葡萄糖6 磷酸脱氢酶(G6PD)基因变异的狼疮性肾炎(LN)患者的临床病理资料,并对该基因变异进行文献回顾,将结果报告如下。对象和方法研究对象国家肾脏疾病临床医学研究中心符合SLE1997 年美国风湿病学会分类标准,肾活检病理符合LN,行全外显子测序
14、发现了3例携带G6PD基因变异的患者。收集其基线临床病理及随访资料,对直系亲属进行家系验证,11名实验室健康工作人员作为对照。本研究获得东部战区总医院医学伦理委员会批准(批准文号2 0 2 2 DZKY-061-01),所用样本来自国家肾脏疾病临床医学研究中心生物样本库,所有患者及亲属、健康对照均签署书面知情同意书。全外显子测序及数据分析参照本中心前期建立的方法进行3Sanger测序分别对3个家系基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。扩增产物送北京擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。扩增引物:F-CTCTCCCTCACAGAA CGTGA;R-AACCCACTCTCTTCATCA
15、GC。G6PD酶活性测定采集先证者外周血5mL,肝素钠抗凝,送至中国医学科学院血液病医院血液学研究所,使用G6PD/6磷酸葡萄糖脱氢酶(6 PGD)比值法检测G6PD酶活性。定量 PCR(qPCR)病例1、病例2 及8 例健康对照的血样提取RNA后,参照本中心前期建立的qPCR方法检测干扰素刺激基因IFIT1、IFI44L、RSAD2、ISG 15、O A S1 和 MX2 的表达4。细胞因子微球检测(CBA)采用CBA法检测病例1、病例2 及11例健康对照血清样本中的白细胞介素(IL)6、IL-8 及干扰素诱导蛋白10(IP-10)浓度,数据采用FCAPArrayversion3软件分析获取
16、精确浓度。结果临床资料3例患者中2 例男性、1例女性,发病年龄分别为6 岁、33岁和2 6 岁。分别来自山东、福建和广西省。均有血液系统受累。病例1以血小板减低起病,病例3以贫血起病。均无消化系统、神经系统、心脏等系统特殊表现(表1)。3例患者均为正细胞正色素性贫血,其中病例2 与病例3曾有游离血红蛋白升高、结合珠蛋白下降,3例患者均红细胞碎片阳性,直接及间接Coombs试验均阴性,网织红细胞比值正常(表2)。病程中病例1曾有1次肺部感染病史,病例2 曾有肺结核病史,病程中有2 次肺部感染。3例患者均无黄疽、腹痛、脾大、血红蛋白尿表现。就诊时病例1与2 免疫球蛋白水平偏低,3例均无粒细胞减少和
17、自身免疫性疾病家族史肾脏病与透析肾移植杂志第32 卷第3期2023年6 月209表13例患者临床病理资料病例1病例2病例3性别男男女发病年龄(岁)63326SLE诊断年龄(岁)123327肾活检年龄(岁)173427病程(年)21716发热有无无皮肤黏膜损害全身红口腔脱发疹、脱发溃疡浆膜腔积液无胸腔、腹无腔、心包积液肌肉关节症状无多关节无痛贫血有有有白细胞减低有有有血小板减少有有有肾脏损害中等量急进性大量蛋白蛋白尿、肾炎综尿、镜下血镜下血合征尿尿、慢性肾功能不全肾脏病理肾小球数(个)302520肾小球硬化(%)6080肾小球节段硬化(%)6.67120细胞性/纤维细胞性新3.331615月体(
18、%)毛细血管内增生(评分)033白细胞浸润/核碎裂022(评分)祥坏死(评分)002白金耳(评分)011间质炎症(评分)211肾小管菱缩(评分)200间质纤维化(评分)200病理分型LN-IILN-IVLN-IV+V活动指数4911慢性化指数720治疗用药激素、激素、激素、CsA、MMF、血CTX,TW、FK506浆置换、HCQCTXFK506、TW、TW、HCQHCQ转归终末期完全完全肾病、肾缓解缓解移植SLE:系统性红斑狼疮;LN:狼疮性肾炎;CsA:环孢素A;FK 50 6:他克莫司;CTX:环磷酰胺;MMF:吗替麦考酚酯;TW:雷公藤多苷片;HCQ:硫酸羟氯喹表2 3例患者肾活检时实验
19、室检验资料病例1病例2病例3尿蛋白定量1.49个12.33个4.13 个(g/d)尿红细胞计数201100175个(万/mL)白细胞计数13.3个1.911.8(10%/mL)中性粒细胞/淋巴76/1754.1/25.453/34细胞(%/%)CD4+T淋巴细胞559301225计数(个/uL)血红蛋白(g/L)106591691平均红细胞容积89.995.996.2(fL)平均红细胞血红29.931.831.3蛋白量(pg)网织红细胞(%)2.311.530.3游离血红蛋白NA187.36.8(mg%)(mg/L)结合珠蛋白NA294.737(mgHb%)(ng/mL)溶血实验NA阴性阴性血
20、小板132112341(10%/mL)血清肌酐168.84 341.22 82.21(mol/L)eGFRmL/(min:50.3919.10 84.51 11.73m)阳性自身抗体ANA、ANA、抗ANA、抗dsDNA、抗dsDNAClq抗体、抗nRNP、抗SM、核小体抗抗SSA、抗SSB、体、抗SSA、ACA、抗血小板抗SSB抗体IgA(g/L)0.342 1.453.18IgG(g/L)3.295.8522.21IgM(g/L)0.1950.4590.837补体 C3(g/L)0.9530.327 0.286 1补体 C4(g/L)0.3140.1480.037红细胞碎片10枚/全片11
21、%2%10枚/全片SLE-DAI82520G6PD酶活性缺乏缺乏缺乏ANA:抗核抗体;dsDNA:双链DNA;A CA:抗心磷脂抗体;nRNP:核糖核蛋白;SSA:干燥综合征A抗体;SSB:干燥综合征B抗体;SLE-DAI:系统性红斑狼疮疾病活动度评分;eGFR:估算的肾小球滤过率;G6PD:葡萄糖6 磷酸脱氢酶;NA:无数据肾组织病理改变病例1 为 LN-II型,慢性病变为主活动指数(AI)4分,慢性指数((CI)7分,病例2 为LN-IV型(AI9分,CI2分),病例3为LN-IV+V型(AI11分,CI0分)(表1)。肾组织中均未见血栓性微血管病(TMA)等血管病变Vol.32No.3J
22、un.2023JNephrolDialyTransplant210:基因检测结果病例1的X染色体上G6PD基因的12 号外显子发生c.G1466T变异致第48 9号精氨酸转变为亮氨酸(p.R489L)(NM _0 0 0 40 2.4),其母亲为c.G1466T(p.R489L)杂合变异。病例2 和其哥哥亦为G6PDc.G1466T(p.R48 9L)半合子变异,母亲为此位点杂合变异。病例3和其姐姐为G6PDc.G1466T(p.R489L)/c.G 147 8 A(p.R493H)的复合杂合变异。其父亲为c.G1478A(p.R493H)半合子变异,母亲为c.G1466T(p.R489L)杂
23、合变异,弟弟为c.G1466T(p.R48 9L)半合子变异,女儿为c.G1478A(p.R493H)杂合变异(图1)。上述变异经ACMG指南判定为致病变异AP1F1P1F2P2F1P2F2P3F1P3F2XWTYXR489LXWTXWTYXR489LXWTXR493HYXR489LXWTP2F3P2F4病例2病例3病例1(P2)(P3)P3F3P3F4P1F3(P1)XR489LYXWTXWTXR489LYXWTXWTXR489LXR493HXR489LXR493HXR489LYXR489LYP2F5P2F6P2F7P3F5正常女性患病女性XWTYXWTYXWTYXWTXR493H正常男性杂
24、合携带女性纯合携带男性复合杂合携带女性患病男性先证者BGCTCCGTGGGGTCCGGGGCTCGTGG GCCGGCGTAT/T病例1病例2病例3(P1)(P2)(P3)P2F1P3F1P1F2MP2F2P3F2P1F1P2F3P3F3P1F3P2F4P3F4P2F5P3F5图13例狼疮性肾炎患者家系遗传资料A:家系图及突变基因型;B:Sa n g e r 测序结果,箭头所示为变异位点;X:X染色体;Y:Y 染色体;P:患者;F:家系成员;R:精氨酸;H:组氨酸;L:亮氨酸;WT:野生型G6PD酶活性测定3例患者的G6PD酶活性测定均提示G6PD酶缺乏。治疗与预后疗病例1在我院就诊时已慢性肾
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