养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制_曲疆奇.pdf
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1、第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-131文章编号:2095-1388(2023)01-0012-10养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制曲疆奇1,刘青2,张清靖1,杨浩辰1,2,赵萌1,朱华1(1.北京市农林科学院水产科学研究所 渔业生物技术北京重点实验室,北京 100068;2.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023)摘要
2、:为探讨养殖尾水处理中浮床水生植物根际细菌对水体氮循环的影响机制,采用 16S rRNA 基因扩增子测序和宏基因组测序技术方法,对浮床水生植物黄花鸢尾(Iris wilsonii C.H.Wright)根际细菌、水体细菌的群落结构及其与氮循环相关的功能基因丰度差异特征进行了研究。结果表明:生态浮床水生植物根际细菌以变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、Patescibacteria 门和拟杆菌门(Bacteroidota)为主要优势门类;在属水平上,有 10 种关键功能菌属在氮素迁移转化关键过程中发挥了重要作用;与水体相比,水生植物根际细菌多样性较高,氮代
3、谢活动更为活跃(P0.05),且主要参与碳代谢、转运蛋白、细菌双组分调节系统和群体感应等代谢功能途径;根际细菌固氮功能基因(nifH、nifD 和 nifK)、硝化作用功能基因(hao)、反硝化作用功能基因(nirS、norB 和 nosZ)、异化/同化硝酸盐还原基因(napA、nrfA、nirB 和 nasA)及其 6 个氮循环关键酶的相对丰度均显著升高(P0.05)。研究表明,生态浮床水生植物根际的氮素周转能力强于周围水环境,其生物脱氮的最主要方式是反硝化和异化硝酸盐还原过程。关键词:水生植物;生态浮床;根际微生物;氮循环作用中图分类号:S 949 文献标志码:A 生态浮床技术是一项造价成
4、本较为低廉、管理便捷且无能源消耗的环境友好型水质调控修复技术1,该技术被广泛应用于富营养化河湖水体和黑臭水体的生态修复和造景中2-3。水生植物是生态浮床最主要的组成成分之一。生态浮床可以利用水生植物根系主动吸收水体中的一部分氮、磷等营养物质以满足自身生长所需;同时,其根系在水中分散面积较大,可为微生物生长提供附着位点,并逐渐形成生物膜。水生植物根系分泌的氧气促使植物根系生物膜持续生长,并在胞外聚合物的作用下形成了“好氧-兼氧-缺氧”的微生物共生体环境,为水生植物根际氮循环过程和氮素转化提供了良好的场所,从而加速了大分子污染物的降解和转化,并达到水质净化的目的4。因此,深入了解浮床水生植物根际微
5、生物群落结构及其功能对养殖池塘水质调控至关重要。中国是内陆水产养殖第一大国,渔业产业关系到民生和社会稳定,处理好养殖尾水环境污染问题是当前渔业发展面临的重要问题。实践证明,生态浮床是当前水产养殖生态沟渠、生态塘和潜流湿地等尾水处理设施升级改造的重要组成部分。目前,关于生态浮床的研究多集中在浮床水生植物的筛选5及生态浮床对水体污染物的吸收和净化效果6等方面,而对浮床水生植物的根际生态调控过程研究不够深入,缺乏浮床水生植物根际氮循环功能微生物群落生态特征与作用研究。宏基因组学为探究环境与微生物生态功能间的相互作用开辟了新的研究途径。宏基因组高通量测序技术在植物修复7、重金属生物修复8、污染区域有毒
6、物质降解9和河流健康生态系统评估10等生态学研究方面显示出巨大的潜力,能够揭示生态系统中微生物群落的动态、功能潜力和生物地球化学过程。本研究中,以养殖尾水生态塘系统内浮床水生植物黄花鸢尾(Iris wilsonii C.H.Wright)根 收稿日期:2022-04-25 基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2020YFD0900103);北京市农林科学院青年科研基金(QNJJ202020);河北省重点研发计划(22326701D,19226703D);现代农业产业技术体系北京市渔业创新团队项目(BAIC07-2022-06)作者简介:曲疆奇(1985),男,副研究员。E-ma
7、il:quqi20122012 通信作者:张清靖(1974),男,研究员。E-mail:zhangqjhbs 际细菌为研究对象,通过宏基因组高通量测序技术分析植物根际细菌类群、多样性及氮循环功能基因富集特征,同时确定在养殖尾水脱氮处理中发挥关键作用的功能细菌类群,以期为养殖尾水浮床生态修复实践应用提供科学参考。1 材料与方法1.1 材料本试验于 2020 年在北京市农林科学院水产科学研究所示范基地养殖尾水生态浮床系统(长宽深为 60 m50 m2 m)中进行,所选池塘以大口黑鲈(Micropterus salmoides)为主要养殖鱼类,搭配少量花白鲢。生态浮床及黄花鸢尾均购自河北廊坊莲韵苑水
8、环境景观有限公司。在生态塘中铺设总面积为 250 m2 的生态浮床,并在浮床上栽种黄花鸢尾(16 株/m2)(图 1)。待水生植物栽种生长稳定后,在养殖高峰期的 58 月进行试验。图 1 生态浮床养殖尾水处理系统Fig.1Ecological floating-bed systems for aquaculture tailwater treatment1.2 方法1.2.1 样本采集试验期间,每月分别在生态浮床的前、中、后部采集黄花鸢尾各 1 株,用灭菌剪刀截取水生植物根部装入无菌密封袋中;同时,在相同位点分别采集水生植物周围水体样本各500 mL。将上述样本装入冷藏箱中带回实验室进行前处理
9、。参考陈嗣威等11的研究方法,从每组黄花鸢尾样本随机截取根部 10 g,用去离子无菌水冲洗后,置于装有 10 mL 浓度为 0.1 mol/L 的磷酸钾缓冲液(pH 8.0)离心管中振荡重复洗涤 2 次,然后将根部取出放入装有50 mL 磷酸盐缓冲液离心管中超声波洗涤 10 min,最后将 3 次洗涤液混合后用孔径为 0.22 m 的已灭菌水系微孔滤膜过滤,将滤膜折叠存放于冻存管中,于-80 超低温冰箱中保存,标记为水生植物根际细菌样本 R 组。水体样本经无菌滤纸除杂后,同样通过滤膜抽滤方式获取水体细菌样本,标记为 FW 组。试验期间,共采集 24 个样本用于 16S rRNA 高通量测序和宏
10、基因组高通量测序分析。1.2.2 细菌16S rRNA 基因扩增子高通量测序分析使用 FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美国)提取根际和水体样本细菌 DNA,待所有样本 DNA 浓度和纯度检验合格后,用干冰保存寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行 16S rRNA基因扩增子高通量测序和宏基因组测序。以细菌特异性引物 338F 和 806R(338F:5ACTCCTACGG-GAGGCAGCAG 3,806R:5 GGACTACHVGGGT-WTCTAAT 3)扩增 16S rRNA 基因 V3 V4 高变区,构建测序文库后,基于 illum
11、ina Miseq PE300高通量测序技术对浮床水生植物根际细菌群落结构和多样性特征进行研究。1.2.3 宏基因组测序分析 将 DNA 片段化,筛选约 400 bp 的片段,利用 NEXT flexTM Rapid DNA-Seq(Bio Scientific)构建 PE 文库。采用 Hiseq Xten(Illumina)测序平台进行宏基因组测序,保证每个样本 要 达 到 6G 以 上 数 据。使 用 Fastp 0.20.0(https:/ 原 始 数据 reads 进行质量剪切,去除剪切后长度小于50 bp、平均碱基质量值低于 20 及含 N 碱基的reads,保留高质量的 pair-
12、end reads 和 single-end reads,并对优化序列进行拼接组装。采用 Meta Gene(http:/metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)对拼接结果中的 contigs 进行开放阅读框 ORF 预测,利用 CD-HIT 4.6.1 在线软件(http:/www.bioin-formatics.org/cd-hit/)构建非冗余基因集。最后使用 SOAP Align 2.21 软件(http:/ reads 与非冗余基因集进行比对(95%identity),统计基因在对应样品中的丰度信息,对得到的基因进行 NR(amino acid sequence o
13、f non-redundant protein)物种注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能注释,筛选得到与氮循环代谢相关的基因类群及其相对丰度信息。1.2.4 多样性指数的计算 使用 Mothur 软件在同一分 类 单 元 OTUs 水 平 上 计 算 Shannon(H)、Simpson(D)和 Chao1(S)等 多样指数,并绘制细菌组成图。31第 1 期曲疆奇,等:养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制 H=-Sobsi=1(ni/N)ln(ni/N),(1)D=Sobsi=1ni(ni-1)/N(N-1),(2
14、)S=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)。(3)其中:Sobs为实际观测到的 OTUs 数目;ni为第 i 个OTUs 所含的序列数;N 为所有序列数;n1为只含有一条序列的 OTU 数目;n2为只含有两条序列的OTU 数目。Shannon 指数和 Simpson 指数是估算样本中微生物多样性的重要指数,Shannon 值越大或Simpson 值越小,说明群落多样性越高;而 Chao1指数是用来衡量微生物群落丰富度的指数,指数越大,说明群落丰富度越高。1.3 数据处理使用 Excel 2007 软件和上海美吉生物云平台对试验数据进行处理和作图。采用 SPSS 20 软件对不同组间的 K
15、EGG 代谢功能、氮循环功能基因和关键酶等进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用 T 检验进行组间差异分析,显著性水平设为0.05,极显著性水平设为 0.01 和 0.001。2 结果与分析2.1 细菌多样性及群落结构差异特征通过 16S rRNA 扩增子高通量测序共获得970 172 条有效 16S rRNA 基因序列,基于 97%一致性将序列划分为 2 631 个 OTUs。从表 1 可见,浮床植物根际组(R)的细菌群落 Shannon 指数和Chao1 指数均显著高于水体组(FW)(P0.05),说明浮床水生植物根际细菌多样性高,群落组成更为丰富。表 1 生态浮床植物根际及
16、水体细菌 多样性指数特征Tab.1 Microbial alpha diversity index in plant rhizosphere and water in the ecological floating bed月份month组别group分类单元OTUs香农多样性指数Shannon index辛普森多样性指数Simpson indexChao1 指数Chao1 index5根际 R1 786.6792.95a6.410.17a0.010.00b2 012.58107.30a水体 FW594.67160.00b3.730.89b0.060.04a878.46177.07 b6根际 R
17、2 006.33143.86a5.890.55a0.030.02a2 224.38110.12a水体 FW834.332.08b4.560.06b0.040.01a1 133.0634.04b7根际 R2 037.6770.71a6.350.23a0.010.00b2 248.6552.34a水体 FW1 690.6767.12b4.760.15b0.050.01a2 039.9330.52a8根际 R1 908.00102.21a5.650.55a0.030.03b2 146.3470.63a水体 FW762.67150.90b3.890.91b0.110.12a1 012.53246.08
18、 b总计 total根际 R1 934.70136.40a6.080.48a0.020.02b2 158.00122.27a水体 FW970.58454.34b4.240.71 b0.060.06a1 266.00493.71b 注:同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P0.05)。Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the
19、 same letter within the same column are not significant differences.在门水平上,应用主成分分析(principal com-ponent analysis,PCA)对细菌群落间的物种 多样性进行比较分析,结果显示,浮床植物根际组与水体组在细菌群落组成上存在明显差异(P1%的主要代谢功能通路进行差异性分析。从图 3 可见,试验期间浮床水生植物根际细菌分别在碳代谢、转运蛋白、细菌双组分调节系统、群体感应、原核生物的碳固定途径、甲烷代谢、淀粉与蔗糖的代谢、氮代谢和细菌趋药性等主要代谢途径上发生了明显变化,这些代谢途径及功能所占相对丰
20、度明显高于41大连海洋大学学报 第 38 卷图 2 生态浮床植物根际与水体细菌群落结构及 多样性特征Fig.2 Bacterial community structure and beta diversity in plant rhizoshpere and water in the ecological floating bed表示两组间有差异(P0.05);表示两组间有显著性差异(P0.01);表示两组间有极显著性差异(P0.001),下同。means difference between groups(P0.05);means significant difference between
21、 groups(P0.01);means very significant differ-ence between groups(P0.001),et sequentia.图 3 生态浮床植物根际与水体间细菌代谢功能的差异特征Fig.3 Major microbial metabolic and functional difference between plant rhizosphere and water in the ecological floating bed水体(P0.05)。由此可见,生态浮床植物根际可能是微生物碳、氮代谢活动最主要的场所,对生态浮床养殖尾水处理系统中氮循环过程产
22、生显著影响。2.3 氮循环功能基因和关键酶响应变化从图 4 可见:浮床植物根际和水体细菌主要参与氮循环生物固氮过程(nitrogen fixation),以及生物脱氮过程中的硝化作用(nitrification)、反硝化作用(denitrification)、异化硝酸盐作用(dis-similatory nitrogen reduction,DNRA)和同化硝酸盐还原作用(assimilatory nitrogen reduction,ANRA)等 5 个主要途径;有 11 个参与氮循环的功能基因丰度发生明显变化(P0.05),包括固氮功能基因nifH、nifD 和 nifK(合称 nifHD
23、K),硝化作用功能基因 hao,反硝化作用功能基因 nirS、norB 和nosZ,异化硝酸盐还原功能基因 napA、nrfA 和nirB,以及同化硝酸盐还原功能基因 nasA。51第 1 期曲疆奇,等:养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制图 4 浮床植物根际与水体间氮循环主要功能基因的差异特征Fig.4 Difference characteristics of principal microbial N related functional genes between plant rhizosphere and water in the ecological floatin
24、g bed 从图 5 可见,在氮循环中,有 6 个关键酶的相对丰度发生了显著变化,包括固氮酶、一氧化氮还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化亚氮还原酶、周质细胞色素 C 亚硝酸还原酶和羟胺脱氢酶,这些关键酶主要催化氮循环中的固氮反应、硝化反应、反硝化反应和 DNRA 过程。具体作用过程如下:生物固氮过程是 N2被还原成为 NH+4和其他含氮化合物的过程,主要在固氮酶的电子转移蛋白(由 nifH编码)、亚单位(由 nifD 编码)和 亚单位(由nifK 编码)催化作用下完成;硝化作用中,羟胺脱氢酶将 NH2OH 氧化成 NO-3;反硝化作用中,亚硝酸盐还原酶将 NO-3还原为 NO,然后分别在一氧化氮还原
25、酶和氧化亚氮还原酶作用下,NO 将 N2O 还原为 N2;NO-3也可以通过 DNRA 过程在周质细胞色素 C 亚硝酸还原酶作用下还原为 NH+4,最终完成生物脱氮过程。这表明,上述氮循环中功能基因和关键酶相对丰度均在浮床水生植物根际中所占比例较高(P0.05),显著影响了水体氮循环过程。由此推测,浮床植物根际是养殖尾水处理系统内生物固氮和生物脱氮过程的主要场所。图 5 浮床植物根际和水体间氮循环主要关键酶的差异特征Fig.5 Difference characteristics of principal microbial N related key enzymes between plan
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