乌头子根膨大过程的转录组分析_高静.pdf
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1、DOI:10.13430/ki.jpgr.20221025003植物遗传资源学报 2023,24(3):864-874Journal of Plant Genetic Resources乌头子根膨大过程的转录组分析高静1,2,罗敏1,刘然1,胡漪文1,陈丽娟1,黄利1,王光志1(1成都中医药大学药学院,成都 611137;2成都市郫都区妇幼保健院,成都 611730)摘要:对乌头子根进行转录组测序,探讨调控乌头子根膨大的分子机制。选取乌头膨大过程的3个时间点即S1(1 d)、S2(31 d)、S3(61 d)进行转录组测序,筛选调控乌头子根膨大过程的相关差异表达基因,使用实时荧光定量聚合酶链式
2、反应(qRT-PCR)进行验证。转录组测序组装获得73600条单基因(Unigenes);通过比较转录组分析,得到差异表达基因(DEGs)一共7555条。S2/S1(S2相对于S1)、S3/S2(S3相对于S2)、S3/S1(S3相对于S1)比较组中分别得到2560、2171、6320条DEGs。KEGG富集分析显示差异表达基因主要参与了淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、植物-病原体作用和苯丙烷生物合成等代谢途径;其中淀粉生物合成途径上调而木质素生物合成下调是膨大过程的主要事件。植物激素信号转导中生长素、脱落酸、细胞分裂素和赤霉素这些途径相关基因参与调控乌头子根膨大过程。筛选这些膨大相关途径的
3、差异表达基因进行qRT-PCR,结果与转录组数据表达模式具有一致性。本研究首次探讨乌头子根膨大过程的动态转录变化,挖掘参与调控乌头子根膨大过程的相关候选基因,为进一步研究乌头子根发育调控分子机制提供线索。关键词:乌头;子根发育;膨大过程;转录组Transcriptome Analysis of the Expanded Daughter Root of Aconitum carmichaeliiGAO Jing1,2,LUO Min1,LIU Ran1,HU Yi-wen1,CHEN Li-juan1,HUANG Li1,WANG Guang-zhi1(1Pharmacy School of
4、Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137;2Chengdu Pidu District Maternal and Child Health Care Hospital,Chengdu 611730)Abstract:Transcriptome sequencing was performed on the daughter root of Aconitum carmichaelii(DR)to explore the underlying molecular mechanism regulating th
5、e root expansion.DR at three time points during the expansion stages,namely S1(1 d),S2(31 d)and S3(61 d),were harvested for sequencing.The identified differentially expressed genes(DEGs)were validated by real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR).73600 unigenes were obtained via de no
6、vo assembly,including 7555 DEGs that are differentially expressed by comparative transcriptome analysis.There were 2560,2171 and 6320 DEGs in the three pair-wise comparison groups of S2/S1(S2 with respect to S1),S3/S2(S3 with respect to S2),S3/S1(S3 with respect to S1),respectively.KEGG enrichment a
7、nalysis showed that DEGs were mainly involved in starch and sucrose metabolism,plant hormone signal transduction,plant-pathogen interaction and phenylpropane biosynthesis.The genes in starch biosynthesis pathway were up-regulated and these genes in lignin biosynthesis were down-regulated,which was c
8、onsidered as a sign in the root expansion.The genes related to auxin,abscisic acid,cytokinin and gibberellin were involved in regulating the process of enlargement.Through testing a subset of candidate genes in these pathways using qRT-PCR,a pattern similar to that revealed by transcriptome sequenci
9、ng was revealed.This study is the first to explore the dynamic transcriptional changes in the process of DR enlargement,and excavate the related genes involved in the 收稿日期:2022-10-25 修回日期:2022-12-22 网络出版日期:2023-01-18URL:https:/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221025003第一作者研究方向为中药资源评价与开发利用,E-mail:通信作者:王光志,
10、研究方向为药用植物资源研究,E-mail:基金项目:四川省科技厅应用基础研究项目(2021YJ0110)Foundation project:Sichuan Provincial Science and Technology Department Applied Basic Research Project(2021YJ0110)3 期高静等:乌头子根膨大过程的转录组分析regulation of the enlargement process,which provides clues for further research on the molecular mechanism of DR.
11、Key words:Aconitum carmichaelii;daughter root development;expansion process;transcriptome乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)为毛茛科常用药用植物,其母根加工作为川乌使用,其子根加工后作为附子使用1。目前在四川、云南和陕西等地有大面积栽培。乌头子根主要是由不定根膨大形成的贮藏根。贮藏根是植物为躲避恶劣地上环境进化的特殊贮藏器官,不仅是重要的营养繁殖器官,也是人类和动物赖以生存的食物和药物来源,例如萝卜、甘薯、人参和何首乌等。随着基因组时代兴起,转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各组学
12、技术的使用在阐明植物生长与发育的规律方面扮演着日益重要的角色。目前甘薯、木薯和萝卜等贮藏根类农作物研究较多,而贮藏根类药材研究较少。乌头子根的相关研究主要集中在临床疗效和化合物活性鉴定等方面,关于其生长发育的报道较少,多停留在形态解剖学方面,缺少分子方面研究。了解植物贮藏根形成机制能够为其膨大结构的建成调控以及高产提供理论依据。前期基于形态学和解剖学手段研究了乌头子根发育的过程,将乌头子根膨大过程划分为5个时期,并发现影响乌头子根膨大的因素有形成层和分生细胞活动、初生木质部脊的数目、淀粉积累和木质部木质化程度的加深等2。对其中乌头子根3个膨大阶段即膨大初期、膨大中期和膨大后期进行转录组测序,比
13、较乌头子根不同膨大阶段的基因转录水平差异,挖掘参与调控乌头子根膨大的相关候选基因,为提高乌头子根产量提供参考,为进一步探究乌头子根潜在膨大分子机制提供重要线索。1材料与方法1.1试验材料试验材料采自四川省青川县房石镇(10456 58.73 E,3221 52.93 N,海拔1039 m)当地农民常年栽种的乌头种根,经成都中医药大学药学院王光志教授鉴定为乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)。采收的种根于2020年11月18日栽培在成都中医大学药药用植物园内(10348 18.96 E,3041 31.89 N,海拔504 m)。1.2试验方法1.2.1样品处理从202
14、1年3月6日部分植株的子根伸出(1 d)到2021年8月4日(152 d)子根成熟期间,在1 d(膨大初期开始时间点)、31 d(膨大中期开始时间点)、61 d(膨大后期开始时间点)、121 d(膨大后期结束时间点)时间点分别取直径约为12 mm、4 mm、10 mm、20 mm的子根,分别命名为S1、S2、S3、S4。用灭菌水洗净样品,用灭菌刀去除子根上部芽点、根尖和侧根,液氮速冻,置于-80冰箱中备用。1.2.2RNA提取与测序样品用液氮研磨成粉末,取100 mg按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441,天根)说明书进行总RNA提取;提取后的总RNA通过Agilent 2100检测其
15、纯度、浓度和完整性;按照NEB普通建库方式进行cDNA建库;利用illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序。1.2.3测序数据质控与组装对每条样品的cDNA文库上机测序后得到的原始读段(Raw reads)进行过滤,去除低质量、含接头和未知碱基N含量多的Reads,从而得到高质量读段(Clean reads)。利用Trinity 将 Clean reads 进行从头组装,得到转录本(Transcript),然后使用Corset软件进行聚合去冗余,获得单基因(Unigene)。1.2.4单基因功能注释和分类利用BLAST软件将单基因序列与 NR、NT、Pfam、KOG、Swiss
16、-prot、KO、GO等7个数据库中的相似序列比较,设置Blast比对参数为 E-value10-5,最终获得有注释信息的基因。1.2.5差异表达基因分析用FPKM计算基因表达量。利用DESeq2 R软件筛选差异表达基因,筛选标准为错误发现率 FDR(False discovery rate)0.05且log2 fold change绝对值1。对筛选出的差异表达基因进行KEGG富集分析。从KEGG富集的相关通路中筛选与乌头子根膨大过程相关的差异表达基因。1.2.6qRT-PCR验证总RNA提取同1.2.2,1 g总 RNA 用于逆转录,方法按照 RT EasyTM II(With gDNase
17、)试剂盒说明书进行;逆转录完毕后将cDNA稀释10倍进行qRT-PCR,实验过程按照Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I 试剂盒说明书在T100TM Thermal Cycler PCR仪进行,反应条件为两步法:95 3 min;95 5 s,60 30 s,40个循环。865植物遗传资源学报24 卷以ACT(肌动蛋白基因)为内参,使用2-Ct方法计算基因相对表达量。为确保实验的重现性和可靠性,对样品进行3个生物重复和3次技术重复。引物序列见表1。2结果与分析2.1乌头子根转录组测序结果与功能注释通过质控,共产生56 Gb的有效数据,详见表2。组装后产生 7360
18、0 条单基因,41768 条单基因(56.75%)可以比对到 NR、NT、Pfam、KOG、Swiss-prot、KO和GO等公共数据库(图1A),分别注释了36304 条(49.32%)、19470 条(26.45%)、26015 条(35.34%)、7224 条(9.81%)、26662 条(36.22%)、13033条(17.7%)和26013条(35.34%)单基因。NR数据库注释到的基因同源物种分布如图1B所示,前5分别为耧斗菜(Aquilegia coerulea)、博落回(Macleaya cordata)、莲(Nelumbo nucifera)、葡萄(Vitis vinifer
19、a)、罂粟(Papaver somniferum)。表1qRT-PCR引物信息Table 1qRT-PCR primer information引物名称Primer nameCluster-5683.29966Cluster-5683.36937Cluster-5683.15057Cluster-5683.37263Cluster-5683.32278Cluster-5683.17816Cluster-5683.10302Cluster-5683.36484Cluster-5683.47197Cluster-5683.34778Cluster-5683.42210Cluster-5683.31
20、175Cluster-5683.33017Cluster-5683.30404描述Description肌动蛋白转录抑制响应1生长素响应因子生长素响应因子细胞分裂素A类响应因子ABA反应元件结合因子光敏色素相互作用因子41,4-葡聚糖分支酶淀粉合酶葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶苯丙氨酸解氨酶肉桂醇脱氢酶细胞周期蛋白KNOX1同源异型盒蛋1基因名称Gene nameACTTIR1SAURARFARR-AABFPIF4GBE1GLGAGLGCPALCADCYCD3KNAT1上游引物(5-3)Forward primer(5-3)ACAGGACCAATCAATACTCACCCATACCACGACTTA
21、CACAGCAGTATATGTAGGAGAGGGTGAGTTGTTTACACCGATCACGTTTGGAAGAAGGGGCAGAGGTGGCGGTATAGTCGGTGAAGGTTAATCGGTCTATCGCCTCTGCTTACCGAGCACATCTTGATTATCGGAGCCAGCAACAACTTACGGGAGCACAACACATGGAATACTTAATGAGGCGAAGGTGGAGTTATCACACCCTCTCTTGCCATTCGCCTATTCCACTTCCACCTACCTTCACATCCTCTTCATCT下游引物(5-3)Reverse primer(5-3)TGGCTTCCCTTAGCA
22、CATAATCTCCTTCACTCACTTCCCCGAGATGTGAGGTTGACGAATTCTGTCAATGCCTCTTCGGATGACAGAGTTGACAGGGGTGTAGCGGATTCTCTGTTCTTGACTTGCTGCTTGGTGTATTCTCTGACGAGCCATCCACATTGCCAGACCATAACCACCTTCAATGCGTCCTTCTTCGTCAATCTTCATGCGTGGGTTGATTCAGTCTCGCCTATTCCACTTCCACCTAAGCACCTCATCATCTCCATCTTCCAGTCAGCCTGTTCACTAT表2乌头子根的转录组数据统计结果Table 2Tra
23、nscriptome data of DR样品名称SampleS1_1S1_2S1_3S2_1S2_2S2_3S3_1S3_2S3_3原始读段Raw_reads209498812308048621781232217416142203697221639746222508812021207820604735高质量读段Clean_reads201040262210707520766359208519932117332421258695212771731916469919922852高质量读段碱基数Clean_bases6.06.66.26.36.46.46.45.76.0质量值大于20的碱基在过滤数
24、据中的占比(%)Q2096.9797.1097.1997.1897.2297.3697.0797.1597.01质量值大于30的碱基在过滤数据中的占比(%)Q3091.9892.2392.4592.3992.5592.6292.1692.3992.09GC含量(%)GC content45.7146.0146.0345.7646.2745.5245.7845.7145.77S1、S2、S3表示1 d、31 d、61 d时间点的子根样品组,下同;_1、_2、_3表示各个组的3个生物学重复S1,S2,S3 indicates the DR sample groups at 1 d、31 d、61
25、d time points,the same as below;_1,_2,_3 indicates the 3 biological replicates of each group8663 期高静等:乌头子根膨大过程的转录组分析2.2差异表达基因表达分析通过分析比较转录组数据,获得差异表达基因(DEGs,differential expression genes)共7555条;S2/S1(S2相对于S1)存在2560条差异表达基因,619条表达上调,1941条表达下调;S3/S1(S3相对于S1)存在6320条差异表达基因,2194条表达上调,4126条表达下调;S3/S2(S3相对于S2
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