桑树内生菌的生物活性及应用前景_张锦锦.pdf
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1、植物内生菌是指生活于健康宿主植物组织或器官内部,不会对宿主植物引起明显病害的一类微生物群,包括真菌、细菌和放线菌1。自 1993 年 Stierle 等2首次从短叶红豆杉中分离到 1 株能产生抗癌活性成分紫杉醇的内生真菌以来,内生菌逐渐成为许多学科研究的热点,在农业、食品、医药领域展现出重要的开发价值和广阔的应用前景3。对内生菌进行研究,不仅能丰富紧缺药用资源材料,还能促进物种保护和可持续发展。桑(Morus alba L.)为桑科桑属落叶乔木或灌木,属温带和亚热带植物,原产并广泛种植于中国中部和北部地区,是集食用、药用、饲用、观赏等于一体的生态经济型树种。桑树全身都是宝,上至桑枝、桑摘要:桑
2、树全身是宝。植物内生菌是生活于健康宿主植物组织或器官内部的微生物,其能够产生特殊的活性代谢产物,一直是食品、药品、农业等领域研究的热点。介绍了桑树内生菌的多样性,以及桑树内生菌在抑菌、抑制-葡萄糖苷酶、调节植物生长、抗氧化等方面的生物活性;并对桑树内生菌作为新型微生物资源,在桑树病害防治、果蔬采后保鲜剂开发、1-脱氧野尻霉素(DNJ)发酵生产以及降糖药物开发方面的应用前景进行了展望。以期为桑树内生菌发酵生产功能性物质,开发功能性食品、药品以及果蔬采后生物保鲜剂提供理论参考。关键词:应用微生物学;桑树;内生菌;生物活性;1-脱氧野尻霉素中图分类号:S182文献标识码:A文章编号:1008-163
3、1(2023)01-0085-06收稿日期:2022-11-14基金项目:河北省重点研发计划项目(20327122D,21327115D)作者简介:张锦锦(1996-),女,河南商丘人,硕士研究生在读,研究方向为食品微生物与食品安全。E-mail:。通讯作者:韩俊华(1977-),女,河北景县人,教授,博士,主要从事食品微生物与食品安全研究工作。E-mail:。通讯作者:高林森(1963-),男,河北元氏人,研究员,硕士,主要从事作物栽培技术、农业政策与规划研究。E-mail:。Biological Activity and Application Prospect of Endophytes
4、ZHANG Jin-jin1,SUN Yu-ting1,GUO Ye2,GAO Wen-hui1,HAN Jun-hua1*,GAO Lin-sen2*(1.College of Food and Biology,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Institute of Agricultural Information and Economy,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang050051,Ch
5、ina)Abstract:Mulberry trees are full of treasure.Endophytes are microorganisms living in the tissues or organs ofhealthy host plants,which can produce special active metabolites,and have been the focus of research infood,medicine,agriculture and other fields.The diversity of endophytes in mulberry t
6、rees are introduced,aswell as the biological activities including antimicrobial activity,inhibition of-glucosidase,regulation of plantgrowth,and antioxidant.The application prospects of endophytes as new microbial resources in the control ofmulberry diseases,the development of postharvest preservati
7、ve for fruits and vegetables,the fermentation production of 1-deoxynojrimycin(DNJ),and the development of hypoglycemic drugs are also prospected.It is expected to provide theoretical reference for the production of functional substances by mulberry endophytes fermentation,the development of function
8、al food,medicine and postharvest biological preservative for fruits andvegetables.Key words:Applied microbiology;Mulberry;Endophyte;Biological activity;1-Deoxynojirimycin张锦锦1,孙雨婷1,郭烨2,高文惠1,韩俊华1*,高林森2*(1.河北科技大学食品与生物学院,河北石家庄050018;2.河北省农林科学院农业信息与经济研究所,河北石家庄050051)桑树内生菌的生物活性及应用前景DOI:10.12148/hbnykx.202
9、30068河北农业科学,2023,27(1):85-90,98Journal of Hebei Agricultural Sciences编辑杜晓东河北农业科学2023 年叶,下至桑蚕、沙僵蚕等,均具有巨大的药用价值。研究发现,桑叶含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖等,具有降脂、降血压、减肥等功效;桑葚含有花色苷、多酚类、微量元素等,具有抗氧化、抗癌、养颜美容等作用;桑枝含有鞣质、蔗糖、果糖以及丰富的纤维素、半纤维素等,具有清热、祛风、通经络等作用;桑白皮具有止咳平喘、利尿和降压的作用,并能治疗风湿麻木、糖尿病等症状;桑树中还含有丰富的黄酮类化合物、植物甾醇、有机酸等4。此外,桑树的生物碱含量较高
10、,尤其是具有显著降血糖作用的 1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)。桑内生菌在整个生命周期内都生活在桑树体内,与桑树形成互利共生的关系。桑树的各个组织器官在我们日常生活中发挥着重要作用,与其内生菌的作用密不可分5。1桑树内生菌的多样性植物内生菌资源丰富、种类繁多,大部分植物体内含有多种内生菌。同一品种植物,不同季节、不同年龄、不同组织部位,其内生菌的种类也存在一定差异6。郑丽屏7从桑树根、茎、叶中共分离得到 132 株内生菌,其中真菌 106 株、细菌 23 株、放线菌 3 株,包括镰孢霉属、链格孢属、刺盘孢属等数十个属。Luka 等8从白桑上分离出近百种内生菌,其
11、中,细菌种群以 Tatumella(塔特姆氏菌属)、明串珠菌属、Frateuria(弗拉德氏菌属)和假单胞菌属为主,真菌以 Hanseniaspora(有孢汉生酵母属)、隐球菌属、枝孢菌属和 Phoma(茎点霉属)为优势菌属。内生菌的分离多采用组织分离法,消毒时选择不同浓度的乙醇、NaClO、HgCl 等溶液,通过对植物表面进行不同时间的浸泡,达到去除表面微生物的目的9。目前,内生菌的分离方法通常采用常规的分离培养,然而由于生长条件的限制,导致许多不可被常规培养的内生菌10被忽略。吴燕燕等11分别利用传统分离培养法和基于 IlluminaMiSeq 的高通量测序技术分析了桑树内生细菌的多样性,
12、结果显示,通过高通量测序得到的菌群数量远远高于传统组织分离培养法,采用传统分离培养法会有大量不可培养的内生菌被忽略。Ting 等12也采用基于 Illumina 的测序方法,对不同品种、不同季节的桑树内生细菌分布情况进行了研究,结果表明,不同品种的桑树,春季内生菌主要为变形杆菌门和放线菌门,秋季内生菌以变形杆菌门为主,核心菌属超过 20 种,其中 Pantoea(泛菌属)、Methylobaterium(甲基杆菌属)和 Pseudomonas(假单胞菌属)的丰富度较高。近年来,从桑树不同部位分离到了许多种类的内生菌(表 1)。表 1桑树内生菌的种类Table 1Species of endop
13、hytes in Mulberry菌属泛菌属(Pantoea)、甲基杆菌属(Methylobaterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)链格孢菌(Alternaria sp.)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)假单胞菌(Pseudomonas sp.)炭团菌属(Hypoxylon sp.)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensi
14、s)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)棘壳孢属(Pyrenochaeta sp.)假单胞菌(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)刺盘孢属(Colletotrichum)、茎点霉属(Phoma)、拟茎点霉属(Phomopsis)等 7 个属镰孢霉属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、柱霉属(Scytalidium)等 21 个属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)成团泛菌(P.agglomerans)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单孢菌属(Pseudo
15、monas sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、短小杆菌属(Curtobacterium sp.)洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)嗜麦芽寡养假单胞杆菌(Stenotrophomonas maltophilia)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)参考文献 12,13 14,15 16 17 18 19 20 21 22 23 5 24 25 26 27 28 29 30 31 32 分离部位桑枝桑树桑叶桑树树茎桑叶、茎桑叶、枝桑树根、茎、叶桑叶、柄、幼茎、根、花蕾桑叶、根、茎、桑子86第 1 期2桑树内生菌的生物活性内生菌为植物菌群的重
16、要组成部分,已从多种植物中分离得到,其中一些菌种已在植物保护领域显示出巨大的应用潜力,如加速种子萌发、促进植物生长、提高肥料利用率等33,34。内生菌在与宿主植物和谐共生过程中产生的活性物质也是抗菌、降血糖、抗氧化等食品或药品开发的重要潜在资源。2.1抑菌活性因病原菌导致的桑树病害大约有 150 种,其中近30 种病害会对桑树造成严重生长发育不良、桑果产量低、桑果品质劣变等问题,如桑疫病、桑炭疽病、桑葚菌核病等。目前,桑树病害防控主要是利用化学药剂,但长期使用化学药剂会导致农药残留、抗药性等问题越来越凸显。研究表明,药用植物内生菌在某种程度上具有一定的抑菌活性35。近年来,利用内生菌进行生物防
17、治已逐渐成为备受关注的植物防治新策略,展现出广泛的应用前景。王若琳等23从桑树茎中分离到 17 株内生细菌,并从中筛选出 1 株对桑断枝烂叶病菌 Boeremia exiguaGXH1 具有显著拮抗作用的菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),该 菌 株 对 核 地 杖 菌(Scleromitrula shiraiana)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等其他 11 种病原菌具有不同程度的抑制作用,该研究为桑叶病害的生物防治提供了安全和有效途径。谢洁等22从健康的桑茎中分离得到 1 株对桑葚核地杖菌具有显著拮抗作用的内生菌特基拉芽孢杆菌(Bac
18、illus tequilensis),该菌株的发酵液对桑葚核地杖菌的抑菌率高达 100%,田间试验结果表明该菌株是开发桑葚菌核病生防制剂的理想菌株。桑树是蚕桑产业的重要物质基础,也是我国传统的药用植物,但目前桑树病害严重,因此寻找安全无害的治理方法是非常必要的。2.2产-葡萄糖苷酶抑制剂-葡萄糖苷酶抑制剂是目前治疗型糖尿病的常用药物,已广泛应用于糖尿病的治疗。DNJ 是一种有效的-葡萄糖苷酶抑制剂,具有显著的降血糖作用。1976 年 Yagi36首次从桑根皮中分离到天然 DNJ,之后又在桑枝、桑叶以及其他植物中陆续发现。目前,桑枝、桑叶作为中药治疗糖尿病,已在我国临床上应用。有研究报道,大多数
19、药用植物内生菌能够产生与其宿主植物相同或相似的生物活性物质37。桑树是DNJ 含量很高的植物之一32,因此,从桑树中筛选能够产-葡萄糖苷酶抑制剂的内生菌受到广泛关注。但截至目前,从桑树内生菌中筛选出产-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株报道尚不多见。武婷婷等25从桑树的内生菌中筛选得到 1 株产-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株 S-J-X-4,初步判定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。叶晶晶32从桑树中分离得到 2 株高产 DNJ的内生菌嗜麦芽寡养假单胞杆菌和藤黄微球菌,2 个菌株的发酵液提取物对-葡萄糖苷酶均具有很好的抑制作用,且其中 1 个菌株的发酵产物与 DNJ 在降低糖尿病小鼠血糖
20、和改善糖尿病症状方面表现出相同的效果38。郑丽屏等13从桑枝中分离得到 1 株产-葡萄糖苷酶抑制剂的内生真菌 SZ-2,经鉴定为链格孢属(Alternaria sp.),其菌丝多糖具有显著抑制-葡萄糖苷酶的作用,有望成为新型的-葡萄糖苷酶抑制剂。在该研究中,其还进一步探究了内生菌 SZ-2 菌丝多糖的生物活性,发现内生菌次生代谢产物的生物活性与宿主植物次生代谢产物的生物活性一致。贾亚楠等17从桑枝中分离到内生假单胞菌,其代谢产物对-葡萄糖苷酶也表现出一定的抑制作用,该研究也为利用桑树内生菌发酵生产天然降血糖药物提供了理论依据。骆丽如等18进一步对从桑树枝叶中分离得到的内生真菌及其利用桑叶粉末产
21、生 DNJ 的效果进行了研究,初步认为,该内生真菌在 PDA 培养基中自身不能产生 DNJ,但能将桑叶中的某些物质转化成 DNJ,进而增加 DNJ 含量。后续研究可以继续探讨桑树内生菌与 DNJ 积累的关系,以明确桑树内生菌与桑叶组织或悬浮细胞共同培养是否可以提高内生菌的 DNJ产量。目前国内外市场对 DNJ的需求均处于供不应求的状态,上述研究也为提高 DNJ 含量提供了新的研究思路和依据。目前,国内外已有许多研究报道了利用微生物合成-葡萄糖苷酶抑制剂的方法3941,但是利用桑树内生菌产-葡萄糖苷酶抑制剂并用于临床治疗高血糖的方法仍有待深入研究,需要综合考虑菌株的安全性、DNJ 产率和提取成本
22、等。2.3调节植物生长植物内生菌对宿主植物的促生长作用主要表现在对植物种子萌发和生根生长的促进,对植物本身不造成损伤,且对环境友好。研究表明,部分植物内生细菌可以通过产生植物激素42、生物固氮作用、光合作用、合成铁载体43,44等,促进植物对氮、磷、钾、铁等矿物质的吸收,以及改善土壤微环境等方式促进植物生长。Xu 等24从 33 株桑内生拮抗菌中筛选出 8 株内生细菌,并进行盆栽试验,结果表明,8 株供试内生菌张锦锦等:桑树内生菌的生物活性及应用前景87河北农业科学2023 年对桑树幼苗生长均具有不同程度的促进作用。其中,1.0107CFU/mL 芽孢杆菌菌液处理的桑树幼苗,芽长和根鲜重分别较
23、未处理提高了 83.37%和 217.70%,表现出显著的促生长作用。从桑叶中获得的内生细菌洋葱伯克霍尔德Lu10-1 能够产生生长素,有助于磷的溶解和固氮酶活性的提高,能在桑树幼苗中快速、高效繁殖和传播,是一种高效的桑树幼苗生长促进剂45。从健康桑树茎中分离到的 1 株内生芽孢杆菌 sp.7PJ-16,通过合成吲哚-3-乙酸以及铁载体,表现出很强的促进植物生长的能力46。从健康桑树根中分离出的内生凝集泛菌 SWg2 也能显著促进桑树幼苗生长,采用 107CFU/mL 的 SWg2 菌悬浮液浸种后,桑树种子发芽率和胚根长度分别提高了 100%和144.2%47。高绘菊等先后从桑树中分离出内生细
24、菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)9和内生真菌Macrophominaphaseolina48,其中一定浓度的枯草芽孢杆菌培养液能显著提高玉米和桑树种子的发芽率,明显增加植株鲜重,对 2 种植物幼苗生长均具有明显的促进作用。可以看出,从桑叶、茎、根等不同部位分离到的内生菌,均对植株生长具有一定的促进作用。目前,我国市场上鲜有植物内生菌的生长促进剂,植物生长调节剂也多为仿制国外产品,品种较少且缺乏创新性。因此,开发新型、更安全、环保的植物生长促进剂和调节剂,将是一个新的契机和挑战。2.4抗氧化活性桑树内生菌不仅在抑菌、促生长和降血糖方面倍受关注,其抗氧化能力也不容忽视。郑丽屏7
25、研究报道,桑内生真菌产生的胞外多糖可以显著抑制乳酸脱氢酶活性,并维持过氧化物酶和过氧化氢酶活性,在降低细胞膜脂质过氧化和过氧化氢损伤方面表现出积极作用。贾亚楠等17也发现,桑内生假单胞菌的发酵液具有很强的清除 ABTS 自由基和 DPPH 自由基的活性。而柴建萍等49早在 2009 年就已经从 3 种桑树品种中分离得到了可以产黄酮类物质的内生真菌,其发酵培养液中黄酮类物质含量为 0.01 mg/mL 左右。因此,内生菌生长过程中产生的多糖及黄酮类物质很可能是其抗氧化活性的主要原因。而且,已有罗汉果内生菌50、银杏内生菌51、五味子内生菌52、人参内生菌53、黄精内生菌54生长代谢中产胞外多糖、
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