晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的转录组学分析_袁畅.pdf
《晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的转录组学分析_袁畅.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的转录组学分析_袁畅.pdf(13页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、3期691晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的转录组学分析袁畅1,李蔚2,何苹萍2,陆专灵2,黄彬胜2,王大鹏2*,李文红1*(1广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;2广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁530021)摘要:【目的】运用转录组测序技术探究不同晒田环境胁迫下克氏原螯虾卵巢的基因表达变化,筛选出与其卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为研究晒田胁迫方式促进克氏原螯虾卵巢发育的作用机制提供理论依据。【方法】以雌性克氏原螯虾为研究对象,分别在晒田环境胁迫0 d(CK)、3 d(T1)、7 d(T2)和10 d(T3)时采样,构建卵巢cDNA文库进行转录
2、组测序,对差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析。【结果】共获得86377个Unigenes,在Nr、KOG/COG、Swiss-Prot和KEGG库中成功注释到22712个Unigenes;获得1115个胁迫组(T1、T2和T3)与CK的DEGs。KEGG信号通路富集分析结果表明,DEGs富集的PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路和雌激素信号通路与卵巢发育相关。实时荧光定量PCR验证结果表明,3个DEGs的表达模式与转录组分析结果基本一致,证明转录组数据准确可靠。筛选得到B2M、TUBA1B、MT-CYB、MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、DSX、P
3、ck2、PIM3和serine prote-ase nudel-like等10个与卵巢发育相关的DEGs,并对其表达量进行分析,结果表明各基因在晒田胁迫期间均可调控卵巢发育。【结论】B2M、TUBA1B、MT-CYB、MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、DSX、Pck2、PIM3和serine protease nudel-like等10个DEGs及PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路、雌激素信号通路等3个富集通路在晒田胁迫期间参与卵巢发育调控。关键词:克氏原螯虾;卵巢;发育调控;晒田环境胁迫;转录组中图分类号:S966.12文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)0
4、3-0691-13收稿日期:2022-06-02基金项目:广西创新驱动发展专项(桂科AA20302019-3)通迅作者:王大鹏(1981-),https:/orcid.org/0000-0002-3714-8936,博士,副研究员,主要从事水产养殖技术研究工作,E-mail:;李文红(1966-),https:/orcid.org/0000-0003-1235-8408,博士,教授,主要从事水产养殖技术研究工作,E-mail:第一作者:袁畅(1996-),https:/orcid.org/0000-0003-4554-0687,研究方向为克氏原螯虾工厂化繁育,E-mail:南方农业学报Jour
5、nal of Southern Agriculture2023,54(3):691-703ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.005Transcriptomic analysis of ovary of Procambarus clarkii undersun-drying environmental stressYUAN Chang1,LI Wei2,HE Ping-ping2,LU Zhuan-ling2,HUANG Bin-sheng2,WANG Da-peng2*,LI Wen-ho
6、ng1*(1College ofAnimal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China;2GuangxiAcademyof Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory ofAquatic Genetics,Breeding and Healthy Breeding,Nanning,Guangxi530021,China)Abstract:【Objective】The purpose of the study was to explore the gene ex
7、pression changesin ovaries of Procam-barus clarkii under different sun-drying stresses by transcriptomic sequencing technology,and to screen outthe candidategenes and signaling pathways related to ovarian development,so as toprovide a theoretical basis for studying the mecha-nism of sun-drying stres
8、s in promoting the ovarian development of P.clarkii.【Method】The female P.clarkii were sam-pled at 0 d(CK),3 d(T1),7 d(T2)and 10 d(T3)of sun-drying environmental stress,and ovary cDNA libraries wereconstructed for transcriptome sequencing,and the differentially expressed genes(DEGs)were subjected to
9、GO functionalannotation and KEGG signaling pathway enrichment analysis.【Result】A total of 86377 Unigenes were obtained.Ofthese,22712 Unigenes were successfully annotated in Nr,KOG/COG,Swiss-Prot and KEGG databases.A total of 1115DEGs were obtained between the stress group(T1,T2,T3)and the CK.The res
10、ults of KEGG signaling pathway enrich-ment analysis showed that DEGs enriched on the pathways associated with ovarian development,including PI3K-Aktsignaling pathway,GnRH signaling pathway and estrogen signaling pathway.The real-time fluorescence quantitative54卷南 方 农 业 学 报 6920引言【研究意义】克氏原螯虾(Procamba
11、rus clarkii)又称小龙虾,在20世纪初被引入我国,是我国养殖面积最广和产量最大的淡水虾,也是淡水水产出口创汇的主导产品。克氏原螯虾广泛分布于湖北、江苏等省份,由于冬春季市场价格过高,其人工养殖产业逐渐向气候温暖适宜的华南地区发展。克氏原螯虾的主要养殖模式为稻田养殖,效益最佳的冬闲田养殖阶段在每年10月至次年4月;获得苗种的主要途径为人工繁殖,出苗量最大的长江中下游地区供苗高峰期在每年46月,与冬闲田养殖存在时间差。为保障秋冬季养殖的苗种供应,提高苗种产量,优化繁育促熟技术迫在眉睫。克氏原螯虾繁殖期时间跨度大,雌雄交配现象在每年春冬季外的大部分时间均可发现,当雌虾卵巢未成熟时也会发生交
12、配,交配后,雄虾精子排入雌虾纳精囊内保存,直到卵巢成熟、排卵,产生抱卵现象(王庆,2012;徐增洪等,2014)。生产实践表明,晒田能提高克氏原螯虾卵巢成熟的同步性,促使其提前抱卵,提高抱卵同步率,且具备杀灭敌害生物的效果,在生产上已广泛使用。因此,了解晒田促熟卵巢的分子机制,对发展新的繁殖相关技术具有重要意义。【前人研究进展】转录组测序技术已广泛应用于水产动物的病原体感染(Lee et al.,2021;Liu et al.,2021;Yang et al.,2022)、免疫调节(Jiao et al.,2019;Jiang et al.,2021;Dinget al.,2022)、神经调节
13、(Veenstra,2015;He et al.,2019;Costa et al.,2021)和性腺发育(Wang et al.,2020;Zheng et al.,2021;Zhong et al.,2021)等方面的分子机制研究。近年来,转录组技术作为研究虾类性腺发育的重要手段,对探寻提升虾类繁殖性能具有重要意义。相关报道表明,在克氏原螯虾中,DNA复制、细胞周期、错配修复、嘧啶代谢、减数分裂酵母和核苷酸切除修复等KEGG通路及Vg、cyclinB、CDK2和Dmc1等差异基因共同参与调节性腺发育(Jiang et al.,2014;Shen et al.,2014);对雌性斑节对虾(P
14、enaeus monodon)投喂多毛类动物并切除单侧眼柄后,参与调控脂肪酸调节、能量生成和激素介导卵母细胞成熟等通路的重要基因,如MAPKK、PGM-RC1及cytochrome等高表达,协同诱导卵巢成熟(Sit-tikankaew et al.,2020);日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)卵巢在繁殖期间可快速且周期性成熟,其溶酶体通路中富集的相关基因cathepins、legu-mains和cystatin,可保护卵黄原蛋白水解,且myosinheavy chain 67参与了卵母细胞的排出(Zhang et al.,2021);通过增加甘油三酯和甾醇等营养物质的
15、含量及提高雌激素、雌二醇、甲基法尼苷等相关激素的分泌,从而促进雌性南美白对虾(Litopenaeus vanna-mei)卵巢发育(Liang et al.,2022)。根据有关研究报道,温度(张聚涛,2011;王庆等,2012)、隐蔽物(宋光同等,2015)、光照(孙珂,2019)等环境因素可促进克氏原螯虾卵巢成熟,通过温棚反季繁育(文玲梅等,2018;刘国峰等,2021;宋光同等,2022)及工厂化离体繁育(许洪杰等,2020)等方式可促进亲虾繁育,但还未有生产技术可实现克氏原螯虾卵巢稳定成熟。环境胁迫会影响能量的最佳分配,包括生长、繁殖和储存等(Sokolova,2013)。卵黄是胚胎发
16、育主要的能量储备,卵黄生成的平衡改变可能会导致严重的生殖障碍(Arambourou et al.,2020);纳米聚苯乙烯(PS NPs)与除草剂阿特拉津胁迫克氏原螯虾卵巢发育,导致其卵黄原蛋白(Vtg)表达下调、卵母细胞较小(Silveyra et al.,2018;Capanni et al.,2021);萘会引起卵巢封闭,促使卵黄发生前期和卵黄发生期的卵母细胞退化(Sarojini et al.,1995)。但也有学者曾尝试利用胁迫因素加强克氏原螯虾卵巢发育,以了解其发育的分子机制,曾有研究发现使用法尼酸甲酯(MF)胁迫可刺激卵母细胞成熟,促进卵巢成熟(Laufer et al.,199
17、8)。【本研究切入点】目前,生产中已广泛使用晒田方式对雌虾卵巢进行促熟,进而提高克氏原螯虾的繁殖能力。但晒田促熟卵巢的分子机制尚不明确,仍需深入探讨。【拟解决的关键问题】PCR verification results showed that the expression patterns of the three DEGs was basically consistent with the results oftranscriptome analysis,proving that the transcriptome data were accurate and reliable.The te
18、n DEGs related to ovariandevelopment were screened out,includingB2M,TUBA1B,MT-CYB,MT-ND1,MT-ND2,MT-ND4,DSX,Pck2,PIM3,and serine protease nudel-like.The expressions of these DEGs were analyzed,and the results showed that these genesregulated ovarian development during the period of sun-drying environ
19、mental stress.【Conclusion】In this study,ten DEGsincludingB2M,TUBA1B,MT-CYB,MT-ND1,MT-ND2,MT-ND4,DSX,Pck2,PIM3and serine protease nudel-like,and three enriched pathway sincluding PI3K-Akt signaling pathway,GnRH signaling pathway,and estrogen signalingpathway are involved in the regulation of ovarian
20、development during the period of sun-drying environmental stress.Key words:Procambarus clarkii;ovary;developmental regulation;sun-drying environmental stress;transcriptomeFoundation items:Guangxi Innovation Driven Development Project(GuikeAA20302019-3)3期693时间Time晒田前(0 d)Before sun-drying晒田后(10 d)Aft
21、er sun-drying解剖数量Number ofdissections4040期数量Number ofphase 30期数量Number ofphase 90期数量Number ofphase 253期数量Number ofphase 337成熟率(%)Maturityrate7.592.5从晒田环境胁迫着手,基于转录组技术对克氏原螯虾晒田胁迫期间卵巢发育的分子机制进行分析,筛选出与卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为研究晒田胁迫方式促进克氏原螯虾卵巢发育的作用机制提供理论依据。1材料与方法1.1样本处理与预试验供试克氏原螯虾来自广西来宾市商业养殖场,该场采用稻虾共作养殖模式。选取有环沟的
22、露天池塘,在环沟靠田面一侧顶部,用铁棒和塑料网将田面围住,防止克氏原螯虾逃离田面至环沟掘洞。选取50 kg雌虾,逐个称重后放入池塘,水深控制在3040 cm,让其适应新池塘环境,3 d后将水排干,充分自然曝晒进行晒田环境胁迫,同时停止喂料,促使雌虾在田面掘洞进入繁殖状态。2021年9月2030日期间进行晒田试验,分别于晒田0 d(CK)、3 d(T1)、7 d(T2)和10 d(T3)捕获雌虾,每个时期捕获9只雌虾,随机分成3组样本(每3只雌虾1组),共收集12组样本。收集后的样本立即浸泡在RNA保存缓冲液中,当天转移到-80 冰箱保存备用。晒田可诱导克氏原螯虾掘洞、交配、产卵,是其繁育促熟的
23、关键(奚业文等,2021)。为验证这一观点,本研究采用上述晒田方法,先进行10 d晒田预试验,利用Zhong等(2021)对克氏原螯虾卵巢发育分期的鉴定方法,将晒田前后随机捕获的40只雌虾解剖,其卵巢生长至期确定为卵巢成熟,结果见表1。最终晒田后的雌虾卵巢成熟率为92.5%,表明生产上晒田可促熟克氏原螯虾卵巢。1.2RNA提取、cDNA文库构建和Illumina测序通过TRIzol试剂盒提取每个卵巢样本的总RNA,用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和基因组DNA污染情况,根据试剂盒构建克氏原螯虾卵巢cDNA文库(包括mRNA分离及打断、cDNA双链合成和纯化、cDNA末端修复、加poly(A)尾
24、并连接到Illu-mina测序适配器、筛选200 bp左右cDNA片段、PCR扩增并纯化其产物),使用 Illumina NovaSeq 6000测序仪对cDNA文库进行测序。1.3测序数据组装和功能注释原始Reads通过fastp(Chen et al.,2018)进行质控。过滤掉含有序列适配器、超过10%未知核苷酸(N)和超过50%低质量(Q值20)碱基的数据,得到的高质量数据使用Trinity(Grabherr et al.,2011)拼接成转录本。使用BUSCO(Simoet et al.,2015)对组装转录本进行完整性评估,取每个聚类中最长的转录本作为Unigene参考序列进行后续
25、分析。用BLAST在Nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG/COG数据库进行基因功能注释分析;根据NR数据库注释信息,使用Blast2GO(Conesa,2005)进行GO功能注释。1.4差异表达与基因富集分析将各样本测序得到的Reads在Unigene数据库进行比对,根据比对结果,使用RSEM进行基因表达量水平统计(Li and Dewey,2011)。采用FPKM法表示基因表达量统计和表达量丰度(Pertea et al.,2015,2016)。计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异(DEGs)。采用DESeq2(Love et al.,2014)进行样品组间的差
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 环境 胁迫 下克氏原螯虾 卵巢 转录 分析 袁畅
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。