Notch1信号通路通过上调P15、P21、P57抑制前列腺癌细胞增殖.pdf
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1、论著基础研究 d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 1-8 3 4 8.2 0 2 3.1 2.0 0 5网络首发 h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/5 0.1 0 9 7.r.2 0 2 3 0 1 3 0.1 7 3 4.0 2 2.h t m l(2 0 2 3-0 1-3 0)N o t c h 1信号通路通过上调P 1 5、P 2 1、P 5 7抑制前列腺癌细胞增殖*秦丽霞,李 明,贡强君,周真珍,丁叔波(浙江省金华市中心医院放疗科 3 2 1 0 0 0)摘要 目的 研究N o t c
2、 h 1信号通路在前列腺癌中的作用及其作用机制。方法 在数据库及前列腺癌细胞系中分析检测N o t c h 1的表达情况。在L N c a p细胞系中构建N o t c h 1诱导表达系统,研究N o t c h 1诱导表达后细胞增殖、凋亡及细胞周期分布,并检测细胞周期相关因子表达情况。最后用裸鼠移植瘤形成试验验证N o t c h 1在前列腺癌中的作用。结果 与正常前列腺组织及前列腺正常细胞系相比,前列腺癌组织和前列腺癌细胞中N o t c h 1表达均降低(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后前列腺癌细胞增殖能力减弱(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后通过改变细胞
3、周期而非诱导细胞凋亡使细胞增殖能力减弱(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后细胞周期激酶抑制因子P 1 5、P 2 1、P 5 7表达上调(P0.0 0 1)。N o t c h 1信号通路诱导表达后可以抑制L N c a p细胞在裸鼠体内移植瘤的生长(P0.0 5)。结论 N o t c h 1信号通路通过上调细胞周期激酶抑制因子P 1 5、P 2 1、P 5 7而抑制前列腺癌细胞增殖能力。关键词 N o t c h 1;前列腺癌;增殖;细胞周期激酶抑制因子;P 1 5;P 2 1;P 5 7 中图法分类号 R 7 3 7.2 5 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1-8 3
4、 4 8(2 0 2 3)1 2-1 7 8 9-0 6N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y m e d i a t i n g P 1 5,P 2 1,P 5 7Q I N L i x i a,L I M i n g,G ONG Q i a n g j u n,ZHO U Z h e n z h e n,D I NG S h u b o(D e p a r t m e
5、n t o f O n c o l o g y R a d i o t h e r a p y,J i n h u a M u n i c i p a l C e n t r a l H o s p i t a l,J i n h u a 3 2 1 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n p r
6、o s t a t e c a n c e r c e l l s.M e t h o d s N o t c h 1 e x p r e s s i o n w a s d e t e c t e d i n d a t a b a s e s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s.T h e N o t c h 1 i n d u c e d e x p r e s s i o n s y s t e m w a s c o n s t r u c t e d i n L N c a p c e l l l i n e s
7、t o s t u d y c e l l p r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s a n d c e l l c y-c l e d i s t r i b u t i o n a f t e r N o t c h 1 i n d u c e d e x p r e s s i o n,a n d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f c e l l c y c l e r e l a t e d f a c t o r s.F i-n a l l y,t h e r o l e o f
8、N o t c h 1 i n p r o s t a t e c a n c e r w a s v e r i f i e d b y t u m o r f o r m a t i o n t e s t i n n u d e m i c e.R e s u l t s C o m-p a r e d w i t h n o r m a l p r o s t a t e t i s s u e s a n d n o r m a l p r o s t a t e c e l l l i n e s,N o t c h 1 e x p r e s s i o n i n p r o
9、s t a t e c a n c e r t i s s u e s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s w a s d e c r e a s e d(P0.0 5).A f t e r t h e e x p r e s s i o n o f N o t c h 1,t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r o s-t a t e c a n c e r c e l l s s l o w e d d o w n(P0.0 5).A f t e r t h e e x p r e s s i o
10、n o f N o t c h 1,t h e p r o l i f e r a t i o n o f c e l l s w a s s l o w e d d o w n b y c h a n g i n g t h e c e l l c y c l e i n s t e a d o f i n d u c i n g a p o p t o s i s(P0.0 5).T h e e x p r e s s i o n s o f c e l l c y c l e k i n a s e i n h i b i t o r s P 1 5,P 2 1 a n d P 5 7
11、w e r e u p-r e g u l a t e d a f t e r N o t c h 1 i n d u c t i o n(P0.0 0 1).T h e e x p r e s s i o n o f N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n h i b i t e d t h e g r o w t h o f L N c a p c e l l s i n n u d e m i c e(P0.0 5).C o n c l u s i o n N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h
12、w a y i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y u p-r e g u l a t i n g c e l l c y c l e k i n a s e i n h i b i t o r s P 1 5,P 2 1 a n d P 5 7.K e y w o r d s N o t c h 1;p r o s t a t e c a n c e r;p r o l i f e r a t i o n;c y c l i n-d e p e
13、n d e n t k i n a s i n h i b i t o r;P 1 5;P 2 1;P 5 7 据统计,发达国家中前列腺肿瘤已经超过肺癌成为男性发病率最高的肿瘤1。在我国,虽然前列腺肿瘤的发病率低于欧美等发达国家,但随着人民生活水平的提高和全民肿瘤普查力度的加大,前列腺肿瘤的发病率正逐年升高2。研究前列腺肿瘤发生、发展机制,进而为前列腺肿瘤的临床治疗寻找更有效的治疗手段具有重要的现实意义。N o t c h信号通路是生物界中从果蝇到人类中普遍存在的高度保守的信号通路,在生物组织的发育过程中扮演重要角色3-6。大量的研究表明N o t c h信号通路在多种肿瘤的发生发展中9871
14、重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期*基金项目:浙江省金华市科技计划项目社会发展类重点项目(2 0 1 8-3-0 1 6)。作者简介:秦丽霞(1 9 8 7-),主治医师,硕士,主要从事肿瘤放化疗研究。通信作者,E-m a i l:j h y y y s 1 6 3.c o m。起着关键的作用7-1 4。但N o t c h信号通路在前列腺肿瘤中的作用目前还存在争议。对于不同的肿瘤类型,甚至同一种肿瘤的不同阶段N o t c h的作用并不相同。本研究旨在探讨N o t c h 1信号通路对于前列腺肿瘤细胞增殖的影响及相关机制,为未来利用N o t c h信号通路开展前列腺肿瘤的临
15、床治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 细胞株及主要试剂人源前列腺上皮二倍体细胞RWP E 1,前列腺癌细胞系L N c a p、C 4 2及2 2 R V 1购自中国科学院上海细胞库。DMEM细胞培养液购自美国T h e r m o公司,胎牛血清购自美国T h e r m o公司,脂质体细胞转染试剂(L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0)购自美国I n v i t r o g e n公司,慢 病 毒 质 粒 载 体(p L V X-a c G F P-N 1)购 自 美 国C l o n t e c h公司,细胞裂解液(R I P A)购自上海碧云天生物技术公
16、司,逆转录试剂盒和荧光定量P C R试剂盒购自日本T a K a R a公司,C C K-8试剂盒购自日本D o j i n d o公司,细胞凋亡检测试剂盒购自日本东仁化学科技有限公司。A c t i n、P 1 5、P 2 1、P 5 7和N o t c h 1抗体(一抗以及二抗)购自英国A b c a m公司。1 2只4周龄的雄性S P F级B A L B/C免疫缺陷型裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2 方法1.2.1 R T-q P C R实验 收集11 06个培养细胞,使用T R I z o l试剂提取细胞R NA,经逆转录后再用q P C R仪进行荧光定量P C R反应。
17、记录各组基因扩增的 C t值,基因相对表达:倍数变化=2 -(C ta-C tb)目的基因-(C ta-C tb)a c t i n。C ta为实验组中基因的表达值,C tb为对照组中的基因表达值。每次实验重复3次。荧光定量P C R使用的引物见表1。表1 荧光定量P C R引物序列引物名称引物序列A c t i n正向C A T G T A C G T T G C T A T C C A G G CA c t i n反向C T C C T T A A T G T C A C G C A C G A TN o t c h 1正向G A G G C G T G G C A G A C T A T
18、 G CN o t c h 1反向C T T G T A C T C C G T C A G C G T G AH e y-1正向G T T C G G C T C T A G G T T C C A T G TH e y-1反向C G T C G G C G C T T C T C A A T T A T T CH e s-1正向T C A A C A C G A C A C C G G A T A A A CH e s-1反向G C C G C G A G C T A T C T T T C T T C AP 1 5正向G G G A G G G C T T C C T G G A C A
19、 C G C T G G TP 1 5反向G G T A C C C T G C A A C G T C G C G G T G G CP 2 1正向T G T C C G T C A G A A C C C A T G CP 2 1反向A A A G T C G A A G T T C C A T C G C T CP 5 7正向G C G G C G A T C A A G A A G C T G TP 5 7反向G C T T G G C G A A G A A A T C G G A G A1.2.2 C C K-8法检测细胞增殖将细胞接种于9 6孔细胞培养板中,分别于培养0、2 4、
20、4 8、7 2、9 6 h向各组细胞培养基中加入C C K-8试剂,继续培养2 h,采用全自动酶标仪(波长4 5 0 n m)检测各孔吸光度值(O D),细胞增殖倍数=各时间点细胞O D值/0 h细胞O D值。1.2.3 M a t r i g e l 3 D克隆形成实验取处于对数生长期的细胞消化成单细胞并计数。以2 0 0 0个/1 0 0 L的密度与等体积的M a t r i g e l混合,将混合物滴加到2 4孔板的培孔中心位置,然后置于3 7 恒温培养箱中静置2 0 m i n,待M a t r i g e l混合物完全凝固后,每孔加入1 m L的完全培养基。1 0 d后取出2 4孔板
21、,在显微镜下观察各混合物中细胞所形成的克隆大小和数目,并进行统计。1.2.4 细胞凋亡实验离心收集待检测细胞,弃上清液,使用4 0 0 L 1结合缓冲液重悬细胞,转移至离心管中,并调整细胞密度为11 06个/m L,加入5 L A n n e x i n试剂、5 L P I试剂,4 避光孵育3 0 m i n。转至5 m L流式试管中,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.2.5 细胞周期实验收集待检测细胞,离心弃上清液,用P B S清洗2次。向清洗后的细胞中加入预冷的7 0%乙醇,置于4 冰箱中过夜。第2天使用P B S清洗细胞2次,离心收集细胞并用5 0 0 L的P B S重悬细胞。向细胞悬
22、液中加入终浓度为5 0 g/m L的P I试剂、终浓度为1 0 0 g/m L的R N a s e A酶和 终浓度为0.2%的T r i t o n X-1 0 0试剂,4 避光孵育3 0 m i n。3 0 m i n后移至5 m L流式管中,使用流式细胞仪检测细胞周期情况。1.2.6 E d U染色实验用完全细胞培养基按照1 0 0 01比例稀释E d U溶液,制备5 0 m o l/L E d U培养基;取出培养于9 6孔板中的细胞,每孔加入1 0 0 L制备好的E d U培养基,3 7 孵育2 h。2 h后弃去培养基,P B S清洗细胞2次。向各孔中加入1 0 0 L含4%的多聚甲醛的
23、细胞固定液,室温孵育3 0 m i n,弃固定液清洗后,加入5 0 L 2 m g/m L的甘氨酸溶液,室温孵育5 m i n,P B S清洗2次。各孔中加入1 0 0 L 1A p o l l o染色反应液,避光室温孵育3 0 m i n。弃反应液,P B S清洗2次。滴加1 0 L抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片荧光显微镜下观察并统计分析。1.2.7 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达收集待检测的各组细胞,使用R I P A细胞裂解液裂解细胞,经离心弃沉淀后获得细胞总蛋白溶液,采用B C A法确定蛋白浓度。取各组蛋白样品5 0 g进行十 二 烷 基 硫 酸 钠-聚 丙 烯
24、酰 胺 凝 胶 电 泳(S D S-P AG E),用聚偏二氟乙烯(P V D F)膜转印,加入T B S T抗体稀释液稀释的N o t c h 1、H e y 1、H e s 1、P 1 5、P 2 1及P 5 7一抗抗体孵育过夜,第2天加入HR P标记的二抗抗体室温孵育2 h,P B S洗涤后,E C L显色,用B i o-r a d凝胶成像系统曝光并对图像进行分析。1.2.8 裸鼠移植瘤试验0971重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期(1)细胞准备:将培养的前列腺肿瘤细胞系细胞消化成单细胞并计数,用不含血清的基础培养基将细胞重悬,放于冰盒中。(2)接种细胞:将1 2只雄性裸鼠
25、随机分为两组,每组各6只,每只裸鼠用1 0 0 L 1 0%的水合氯醛麻醉。将不含血清的细胞悬液1 0 0 L(2.51 06个细胞)与等体积的M a t r i g e l混合均匀。用1 m L注射器将细胞悬液注射至裸鼠皮下,待裸鼠清醒后放回笼内饲养。(3)一组小鼠在饲喂的水中添加多西环素(0.5 g/m L),而另一组不添加。每2天观察1次小鼠状态。(4)2 8 d后脱颈处死裸鼠,剥离出皮下肿瘤,测量称重并拍照分析。1.3 统计学处理使用P r i s m G r a p h P a d 5软件进行数据统计分析,计量资料以xs表示,采用t检验;计数资料以例数(百分数)表示,采用2检验,以P
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