Notch1信号通路通过上调P15、P21、P57抑制前列腺癌细胞增殖.pdf

论著基础研究 d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 1-8 3 4 8.2 0 2 3.1 2.0 0 5网络首发 h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/5 0.1 0 9 7.r.2 0 2 3 0 1 3 0.1 7 3 4.0 2 2.h t m l(2 0 2 3-0 1-3 0)N o t c h 1信号通路通过上调P 1 5、P 2 1、P 5 7抑制前列腺癌细胞增殖*秦丽霞,李 明,贡强君,周真珍,丁叔波(浙江省金华市中心医院放疗科 3 2 1 0 0 0)摘要 目的 研究N o t c h 1信号通路在前列腺癌中的作用及其作用机制。方法 在数据库及前列腺癌细胞系中分析检测N o t c h 1的表达情况。在L N c a p细胞系中构建N o t c h 1诱导表达系统,研究N o t c h 1诱导表达后细胞增殖、凋亡及细胞周期分布,并检测细胞周期相关因子表达情况。最后用裸鼠移植瘤形成试验验证N o t c h 1在前列腺癌中的作用。结果 与正常前列腺组织及前列腺正常细胞系相比,前列腺癌组织和前列腺癌细胞中N o t c h 1表达均降低(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后前列腺癌细胞增殖能力减弱(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后通过改变细胞周期而非诱导细胞凋亡使细胞增殖能力减弱(P0.0 5)。N o t c h 1诱导表达后细胞周期激酶抑制因子P 1 5、P 2 1、P 5 7表达上调(P0.0 0 1)。N o t c h 1信号通路诱导表达后可以抑制L N c a p细胞在裸鼠体内移植瘤的生长(P0.0 5)。结论 N o t c h 1信号通路通过上调细胞周期激酶抑制因子P 1 5、P 2 1、P 5 7而抑制前列腺癌细胞增殖能力。关键词 N o t c h 1;前列腺癌;增殖;细胞周期激酶抑制因子;P 1 5;P 2 1;P 5 7 中图法分类号 R 7 3 7.2 5 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1-8 3 4 8(2 0 2 3)1 2-1 7 8 9-0 6N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y m e d i a t i n g P 1 5,P 2 1,P 5 7Q I N L i x i a,L I M i n g,G ONG Q i a n g j u n,ZHO U Z h e n z h e n,D I NG S h u b o(D e p a r t m e n t o f O n c o l o g y R a d i o t h e r a p y,J i n h u a M u n i c i p a l C e n t r a l H o s p i t a l,J i n h u a 3 2 1 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t a n d m e c h a n i s m o f N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s.M e t h o d s N o t c h 1 e x p r e s s i o n w a s d e t e c t e d i n d a t a b a s e s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s.T h e N o t c h 1 i n d u c e d e x p r e s s i o n s y s t e m w a s c o n s t r u c t e d i n L N c a p c e l l l i n e s t o s t u d y c e l l p r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s a n d c e l l c y-c l e d i s t r i b u t i o n a f t e r N o t c h 1 i n d u c e d e x p r e s s i o n,a n d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f c e l l c y c l e r e l a t e d f a c t o r s.F i-n a l l y,t h e r o l e o f N o t c h 1 i n p r o s t a t e c a n c e r w a s v e r i f i e d b y t u m o r f o r m a t i o n t e s t i n n u d e m i c e.R e s u l t s C o m-p a r e d w i t h n o r m a l p r o s t a t e t i s s u e s a n d n o r m a l p r o s t a t e c e l l l i n e s,N o t c h 1 e x p r e s s i o n i n p r o s t a t e c a n c e r t i s s u e s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s w a s d e c r e a s e d(P0.0 5).A f t e r t h e e x p r e s s i o n o f N o t c h 1,t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r o s-t a t e c a n c e r c e l l s s l o w e d d o w n(P0.0 5).A f t e r t h e e x p r e s s i o n o f N o t c h 1,t h e p r o l i f e r a t i o n o f c e l l s w a s s l o w e d d o w n b y c h a n g i n g t h e c e l l c y c l e i n s t e a d o f i n d u c i n g a p o p t o s i s(P0.0 5).T h e e x p r e s s i o n s o f c e l l c y c l e k i n a s e i n h i b i t o r s P 1 5,P 2 1 a n d P 5 7 w e r e u p-r e g u l a t e d a f t e r N o t c h 1 i n d u c t i o n(P0.0 0 1).T h e e x p r e s s i o n o f N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n h i b i t e d t h e g r o w t h o f L N c a p c e l l s i n n u d e m i c e(P0.0 5).C o n c l u s i o n N o t c h 1 s i g n a l i n g p a t h w a y i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y u p-r e g u l a t i n g c e l l c y c l e k i n a s e i n h i b i t o r s P 1 5,P 2 1 a n d P 5 7.K e y w o r d s N o t c h 1;p r o s t a t e c a n c e r;p r o l i f e r a t i o n;c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s i n h i b i t o r;P 1 5;P 2 1;P 5 7 据统计,发达国家中前列腺肿瘤已经超过肺癌成为男性发病率最高的肿瘤1。在我国,虽然前列腺肿瘤的发病率低于欧美等发达国家,但随着人民生活水平的提高和全民肿瘤普查力度的加大,前列腺肿瘤的发病率正逐年升高2。研究前列腺肿瘤发生、发展机制,进而为前列腺肿瘤的临床治疗寻找更有效的治疗手段具有重要的现实意义。N o t c h信号通路是生物界中从果蝇到人类中普遍存在的高度保守的信号通路,在生物组织的发育过程中扮演重要角色3-6。大量的研究表明N o t c h信号通路在多种肿瘤的发生发展中9871重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期*基金项目:浙江省金华市科技计划项目社会发展类重点项目(2 0 1 8-3-0 1 6)。作者简介:秦丽霞(1 9 8 7-),主治医师,硕士,主要从事肿瘤放化疗研究。通信作者,E-m a i l:j h y y y s 1 6 3.c o m。起着关键的作用7-1 4。但N o t c h信号通路在前列腺肿瘤中的作用目前还存在争议。对于不同的肿瘤类型,甚至同一种肿瘤的不同阶段N o t c h的作用并不相同。本研究旨在探讨N o t c h 1信号通路对于前列腺肿瘤细胞增殖的影响及相关机制,为未来利用N o t c h信号通路开展前列腺肿瘤的临床治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 细胞株及主要试剂人源前列腺上皮二倍体细胞RWP E 1,前列腺癌细胞系L N c a p、C 4 2及2 2 R V 1购自中国科学院上海细胞库。DMEM细胞培养液购自美国T h e r m o公司,胎牛血清购自美国T h e r m o公司,脂质体细胞转染试剂(L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0)购自美国I n v i t r o g e n公司,慢 病 毒 质 粒 载 体(p L V X-a c G F P-N 1)购 自 美 国C l o n t e c h公司,细胞裂解液(R I P A)购自上海碧云天生物技术公司,逆转录试剂盒和荧光定量P C R试剂盒购自日本T a K a R a公司,C C K-8试剂盒购自日本D o j i n d o公司,细胞凋亡检测试剂盒购自日本东仁化学科技有限公司。A c t i n、P 1 5、P 2 1、P 5 7和N o t c h 1抗体(一抗以及二抗)购自英国A b c a m公司。1 2只4周龄的雄性S P F级B A L B/C免疫缺陷型裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2 方法1.2.1 R T-q P C R实验 收集11 06个培养细胞,使用T R I z o l试剂提取细胞R NA,经逆转录后再用q P C R仪进行荧光定量P C R反应。记录各组基因扩增的 C t值,基因相对表达:倍数变化=2 -(C ta-C tb)目的基因-(C ta-C tb)a c t i n。C ta为实验组中基因的表达值,C tb为对照组中的基因表达值。每次实验重复3次。荧光定量P C R使用的引物见表1。表1 荧光定量P C R引物序列引物名称引物序列A c t i n正向C A T G T A C G T T G C T A T C C A G G CA c t i n反向C T C C T T A A T G T C A C G C A C G A TN o t c h 1正向G A G G C G T G G C A G A C T A T G CN o t c h 1反向C T T G T A C T C C G T C A G C G T G AH e y-1正向G T T C G G C T C T A G G T T C C A T G TH e y-1反向C G T C G G C G C T T C T C A A T T A T T CH e s-1正向T C A A C A C G A C A C C G G A T A A A CH e s-1反向G C C G C G A G C T A T C T T T C T T C AP 1 5正向G G G A G G G C T T C C T G G A C A C G C T G G TP 1 5反向G G T A C C C T G C A A C G T C G C G G T G G CP 2 1正向T G T C C G T C A G A A C C C A T G CP 2 1反向A A A G T C G A A G T T C C A T C G C T CP 5 7正向G C G G C G A T C A A G A A G C T G TP 5 7反向G C T T G G C G A A G A A A T C G G A G A1.2.2 C C K-8法检测细胞增殖将细胞接种于9 6孔细胞培养板中,分别于培养0、2 4、4 8、7 2、9 6 h向各组细胞培养基中加入C C K-8试剂,继续培养2 h,采用全自动酶标仪(波长4 5 0 n m)检测各孔吸光度值(O D),细胞增殖倍数=各时间点细胞O D值/0 h细胞O D值。1.2.3 M a t r i g e l 3 D克隆形成实验取处于对数生长期的细胞消化成单细胞并计数。以2 0 0 0个/1 0 0 L的密度与等体积的M a t r i g e l混合,将混合物滴加到2 4孔板的培孔中心位置,然后置于3 7 恒温培养箱中静置2 0 m i n,待M a t r i g e l混合物完全凝固后,每孔加入1 m L的完全培养基。1 0 d后取出2 4孔板,在显微镜下观察各混合物中细胞所形成的克隆大小和数目,并进行统计。1.2.4 细胞凋亡实验离心收集待检测细胞,弃上清液,使用4 0 0 L 1结合缓冲液重悬细胞,转移至离心管中,并调整细胞密度为11 06个/m L,加入5 L A n n e x i n试剂、5 L P I试剂,4 避光孵育3 0 m i n。转至5 m L流式试管中,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.2.5 细胞周期实验收集待检测细胞,离心弃上清液,用P B S清洗2次。向清洗后的细胞中加入预冷的7 0%乙醇,置于4 冰箱中过夜。第2天使用P B S清洗细胞2次,离心收集细胞并用5 0 0 L的P B S重悬细胞。向细胞悬液中加入终浓度为5 0 g/m L的P I试剂、终浓度为1 0 0 g/m L的R N a s e A酶和 终浓度为0.2%的T r i t o n X-1 0 0试剂,4 避光孵育3 0 m i n。3 0 m i n后移至5 m L流式管中,使用流式细胞仪检测细胞周期情况。1.2.6 E d U染色实验用完全细胞培养基按照1 0 0 01比例稀释E d U溶液,制备5 0 m o l/L E d U培养基;取出培养于9 6孔板中的细胞,每孔加入1 0 0 L制备好的E d U培养基,3 7 孵育2 h。2 h后弃去培养基,P B S清洗细胞2次。向各孔中加入1 0 0 L含4%的多聚甲醛的细胞固定液,室温孵育3 0 m i n,弃固定液清洗后,加入5 0 L 2 m g/m L的甘氨酸溶液,室温孵育5 m i n,P B S清洗2次。各孔中加入1 0 0 L 1A p o l l o染色反应液,避光室温孵育3 0 m i n。弃反应液,P B S清洗2次。滴加1 0 L抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片荧光显微镜下观察并统计分析。1.2.7 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达收集待检测的各组细胞,使用R I P A细胞裂解液裂解细胞,经离心弃沉淀后获得细胞总蛋白溶液,采用B C A法确定蛋白浓度。取各组蛋白样品5 0 g进行十 二 烷 基 硫 酸 钠-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳(S D S-P AG E),用聚偏二氟乙烯(P V D F)膜转印,加入T B S T抗体稀释液稀释的N o t c h 1、H e y 1、H e s 1、P 1 5、P 2 1及P 5 7一抗抗体孵育过夜,第2天加入HR P标记的二抗抗体室温孵育2 h,P B S洗涤后,E C L显色,用B i o-r a d凝胶成像系统曝光并对图像进行分析。1.2.8 裸鼠移植瘤试验0971重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期(1)细胞准备:将培养的前列腺肿瘤细胞系细胞消化成单细胞并计数,用不含血清的基础培养基将细胞重悬,放于冰盒中。(2)接种细胞:将1 2只雄性裸鼠随机分为两组,每组各6只,每只裸鼠用1 0 0 L 1 0%的水合氯醛麻醉。将不含血清的细胞悬液1 0 0 L(2.51 06个细胞)与等体积的M a t r i g e l混合均匀。用1 m L注射器将细胞悬液注射至裸鼠皮下,待裸鼠清醒后放回笼内饲养。(3)一组小鼠在饲喂的水中添加多西环素(0.5 g/m L),而另一组不添加。每2天观察1次小鼠状态。(4)2 8 d后脱颈处死裸鼠,剥离出皮下肿瘤,测量称重并拍照分析。1.3 统计学处理使用P r i s m G r a p h P a d 5软件进行数据统计分析,计量资料以xs表示,采用t检验;计数资料以例数(百分数)表示,采用2检验,以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 N o c t h 1在前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中表达降低在O n c o m i n e数 据 库 中 分 别 选 取4组(T a l y o r P r o s t a t e、G r a s s o P r o s t a t e、T o m l i n e P r o s t a t e及L i u P r o s t a t e d a t a)芯片阵列数据来检索N o t c h 1的表达情况,分别选择前列腺正常组织、前列腺癌组织统计分类。结果显示N o t c h 1在前列腺癌组织中低表达(图1 A);N o t c h 1在前列腺癌细胞系中表达水平明显降低(图1 B)。A:T a l y o r P r o s t a t e、G r a s s o P r o s t a t e、T o m l i n e P r o s t a t e及L i u P r o s t a t e芯片阵列数据中N o t c h 1表达情况;B:N o t c h 1在RWP E 1、L N C a P、C 4 2和2 2 R V 1细胞系中的表达情况;*:P0.0 5;*:P0.0 1;*:P0.0 0 1。图1 N o t c h 1在前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中表达情况2.2 构建N o t c h 1诱导表达系统为研究N o t c h 1信号通路对前列腺癌细胞的影响,构建可以人为控制N o t c h 1信号通路活化水平的前列腺癌细胞系。首先将N o t c h 1 的胞内片段N I C D克隆到T e t-o n诱导表达系统中。并将该系统通过慢病毒转染整合到前列腺癌细胞系L N C a P的基因组中,将整合后的细胞系命名为L N C a P-N I C D细胞系。随后,对L N C a P-N I C D细胞系进行N o t c h 1信号激活检测。在L N C a P-N I C D的培养基中加入0.5 g/m L多西 环 素(d o x),培 养7 2 h。使 用R T-P C R检 测N o t c h 1信号通路的靶基因H e y 1和H e s 1的mR NA转录水平,结果显示L N C a P-N I C D在多西环素诱导3 d后,H e y 1和H e s 1基因的转录水平明显上升(图2 A)。同时使用W e s t e r n b l o t检测H e y 1和H e s 1的蛋白表达水平,结果显示N o t c h 1诱导表达后H e y 1和H e s 1的蛋白表达较非诱导组明显升高(图2 B)。2.3 N o t c h 1诱导表达后抑制前列腺癌细胞增殖通过C C K-8实验检测L N C a P及L N C a P-N I C D细胞在不同的多西环素浓度水平下细胞增殖速度的变化,结果见图3 A,不同浓度的多西环素不影响野生型 L N C a P细胞的增殖,但在L N C a P-N I C D细胞系中,细胞的增殖速度随着N o t c h 1信号活化水平的上升而下降,表现为负相关,并有明显的计量依赖关系(图3 B)。1971重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期 A:R T-q P C R检测H e y 1和H e s 1的表达情况;B:W e s t e r n b l o t检测H e y 1和H e s 1的表达情况;*:P0.0 5)。N o t c h 1信号激活后,停留在G0/G1期的细胞比例显著增加,而处于S和G2/M期细胞的比例则明显减少,L N C a P细胞的细胞分裂周期变长,见图5。A:C C K-8实验检测不同浓度多西环素对L N C a P细胞增殖的影响;B:C C K-8实验检测不同浓度多西环素对L N C a P-N I C D细胞增殖的影响;*:P0.0 0 1;N S:无差异。图3 不同浓度的多西环素对L N C a P、L N C a P-N I C D细胞增殖的影响 A:L N C a P-N I C D添加d o x组和未添加d o x组的3 D克隆形成情况;B:L N C a P-N I C D添加d o x组和未添加d o x组细胞凋亡情况;N S:无差异。图4 N o t c h 1诱导表达后细胞克隆形成及凋亡情况2971重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期 A:细胞周期中各个阶段的细胞比例;B:细胞经过E d U染色后,L N C a P-N I C D添加d o x组和未添加d o x组的细胞增殖情况。图5 N o t c h 1诱导表达后细胞周期及增殖检测2.5 激活的N o t c h 1信号通路通过上调P 1 5、P 2 1和P 5 7 抑制L N C a P细胞增殖激活N o t c h 1信号通路后细胞周期激酶抑制因子P 1 5、P 2 1和P 5 7基 因 的 表 达 水 平 明 显 升 高(P0.0 0 1),见图6。A:R T-q P C R检 测L N C a P-N I C D添 加d o x组 和 未 添 加d o x组P 1 5、P 2 1和P 5 7 的表达情况;B:W e s t e r n b l o t检测L N C a P-N I C D添加d o x组和未添加d o x组P 1 5、P 2 1和P 5 7 的表达情况;*:P0.0 0 1。图6 N o t c h 1诱导表达后细胞周期相关基因的表达2.6 N o t c h 1信号通路诱导表达后可抑制裸鼠体内L N c a p细胞移植瘤的生长饲喂的水中添加多西环素的裸鼠其皮下移植瘤的体积和重量均显著小于未添加组(P0.0 5),见图7。A:从裸鼠皮下剥离出的皮下移植瘤;B:定量分析皮下移植瘤的重量;*:P0.0 5。图7 N o t c h 1诱导表达后对L N c a p细胞移植瘤生长的影响3 讨 论近年来,随着我国人民生活水平的提,前列腺癌的发病率迅速增长。未来随着我国人口老龄化程度的增大,前列腺癌的发病形势将更加严重。相对于迅3971重庆医学2 0 2 3年6月第5 2卷第1 2期速增长的发病率,我国前列腺癌5年生存率仅6 4%,远低于发达国家的9 2%9 5%。我国虽然已经建立了前列腺癌的筛查机制但并未普及,很多患者初诊已是局部晚期。因此,研究前列腺癌的发病机制,为寻找有效治疗前列腺癌的治疗方案,对我国前列腺癌的临床治疗具有重要的现实意义。近年来,越来越多的研究表明,N o t c h信号通路在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用。但是,对于不同的肿瘤,N o t c h的作用却各不相同,甚至完全相反。例如,N o t c h信号通路的激活与肺腺瘤的预后差显著相关,但N o t c h却能抑制肺鳞癌的发展1 5。即使是在同一种肿瘤中,不同的N o t c h受体也扮演着不同的作用,例如,在膀胱癌中,N o t c h 1被证明是一个抑癌基因,但N o t c h 2却能促进膀胱癌的增殖和转移1 6。N o t c h 3能抑制乳腺癌癌细胞的增殖,但N o t c h 4却是肿瘤干细胞群的标志1 7-1 8。之前对于N o t c h信号通路在前列腺肿瘤中作用的研究,同样显示出了令人困惑的结 果。各 个 研 究 的 结 果 相 互 矛 盾,至 今 关 于N o t c h信号通路在前列腺肿瘤中的作用还没有令人信服的结论。本研究首先通过O n c o m i n e数据库分析N o t c h 1在前列腺癌中表达,发现N o t c h 1在前列腺癌组织中呈低表达。然后R T-q P C R检测发现N o t c h 1在前列腺癌细胞系中的表达也降低。本研究在前列腺癌细胞系L N c a p中 构 建N o t c h 1诱 导 表 达 系 统,利 用C C K-8试验发现N o t c h 1诱导表达后细胞增殖减慢。通过流式细胞仪检测N o t c h 1诱导表达后细胞凋亡及细胞周期分布,证实N o t c h 1激活是通过延长细胞周期,减慢细胞分裂速度而非诱导细胞凋亡的方式抑制细胞的增殖。所以本研究还检测了细胞周期相关基因P 1 5、P 2 1、P 5 7的表达情况,发现当N o t c h 1诱导表达后P 1 5、P 2 1、P 5 7表达上调,证实N o t c h 1信号通路激活后通过延长细胞分裂周期抑制细胞增殖。最后用裸鼠皮下移植瘤试验进一步验证N o t c h 1信号通路在前列腺癌细胞中的抑癌作用。综上所述,本研究证实N o t c h 1是通过上调细胞周期相关因子P 1 5、P 2 1、P 5 7从而改变细胞周期分布抑制细胞增殖,从而抑制前列腺癌的发展。该结果为N o t c h 1抑制剂在前列腺癌临床治疗上的应用提供了理论依据。参考文献1S I E G E L R L,M I L L E R K D,F U CH S H E,e t a l.C a n c e r s t a t i s t i c s 2 0 2 2J.C A C a n c e r J C l i n,2 0 2 2,7 2(1):7-3 3.2 中国抗癌协会泌尿肿瘤专业委员会.中国去势抵抗性前列腺癌诊治专家共识J.中华外科杂志,2 0 2 1,5 4(7):4 8 1-4 8 4.3Z HOU B,L I N W,L ONG Y,e t a l.N o t c h s i g n a-l i n g p a t h w a y:a r c h i t e c t u r e,d i s e a s e,a n d t h e r a-p e u t i c sJ.S i g n a l T r a n s d u c t T a r g e t T h e r,2 0 2 2,7(1):9 5.4S P R I N Z AK D,B L A C K L OW S C.B i o p h y s i c s o f n o t c h s i g n a l i n gJ.A n n R e v B i o,2 0 2 1,5 0(6):1 5 7-1 8 9.5S HE N W,HUANG J,WANG Y.B i o l o g i c a l s i g-n i f i c a n c e o f NOT CH s i g n a l i n g s t r e n g t hJ.F r o n t C e l l D e v B i o l,2 0 2 1,2 6(9):3 3 8.6VANA R O J P,CHA I J A R O E NKU L W,NA B A-NG CHANG 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