基于16S_rRNA基因测...黄褐斑病人肠道菌群差异研究_李琬晴.pdf
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1、收稿日期 修回日期 基金项目 北京中医药科技发展资金项目();北京中医药大学东方医院“”工程项目()作者单位 北京中医药大学东方医院 皮肤科,北京 作者简介 李琬晴(),女,硕士研究生通信作者 张丰川,博士,主任医师:文章编号()临床医学基于 基因测序的黄褐斑病人肠道菌群差异研究李琬晴,蔡玲玲,郭丽媛,王 莹,刘思含,计 广,张丰川摘要目的:利用新一代 测序技术比较黄褐斑病人与健康人的肠道菌群多样性和细菌表型差异。方法:纳入 例黄褐斑病人为研究组,以 名正常人作为健康对照,测序分析粪便样品中细菌群落的结构组成和表型特征。结果:研究组肠道微生物群落丰度、多样性相对降低。研究组拟杆菌门、拟杆菌纲、
2、拟杆菌目、普雷沃菌科、拟杆菌科、普雷沃氏菌、拟杆菌属等丰度显著降低,而厚壁菌门、放射菌门、放线菌纲、乳杆菌目、双歧杆菌目、毛螺菌科、布劳特氏菌等升高,差异均有统计学意义()。结论:黄褐斑病人与健康人肠道菌群存在一定差异。关键词 黄褐斑;肠道菌群;核糖体;多样性;表型中图法分类号 文献标志码 :,(,):,:,():;黄褐斑是常见的难治性面部损容性皮肤病,对病人心理影响较大。据调查显示,患有色素代谢障碍的病人中同时患有抑郁症的比例高达。随着医疗卫生水平的提高,人们愈加关注损容性皮肤病,有关黄褐斑的实验及临床研究也越来越多,尽管如此,本病的机制及病因尚不明确,一般认为与紫外线照射、遗传因素、局部炎
3、症反应、内分泌紊乱等密切相关。年 与 提出“肠 脑 皮肤轴”的概念以来,越来越多的研究提示皮肤疾病与肠道菌群的变化密不可分。皮肤和肠道表现呈生物学二态性,在构成免疫屏障方面具有类似的功能。目前多项研究发现皮肤病可引起肠道菌群的改变,而肠道菌群紊乱也可导致皮肤的变化,二者有相似的神经支配通路机信号转导系统。肠道菌群影响人体的免疫防御能力以及各类营养物质的新陈代谢,肠道菌群紊乱会导致免疫系统和机体内分泌的失衡,从而诱发皮肤色素代谢异常,因此,研究黄褐斑与肠道菌群的内在联系,也是探索本病病因与机制的新方向。资料与方法 一般资料纳入 年 月来北京中医药大学东方医院皮肤科门诊就诊的 例黄褐斑病人(研究组
4、),以来本院体检中心进行常规体检的 名正常人作为对照组。所有研究对象近 周未用过微生物制剂(包括含乳酸菌的食品),近 周内未用过抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。排除合并胃肠道疾病或有消化系统疾病病史者;患有严重的内分泌疾病及代谢性疾病者;具有特定饮食习惯或饮食极不规律者。组性别、年龄()()均具有可比性,并签署知情同意书。粪便样品收集和 提取 收集 组人群的新鲜粪便样品置于无菌冻存管中,保存备 ,用。采用 对样本的基因组 进行提取,之后利用琼脂糖凝胶电泳检测 的纯度和浓度,取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至 。测序根据测序区域的选择,使用带 的特异引物,和高保真 聚合酶对选定
5、(上下游引物序列分别为 和 )可变区进行 扩增。根据 产物浓度进行等浓度混样,充分混匀后使用 浓度 的琼脂糖胶电泳纯化 产物,选择主带大小在 之间的序列,割胶回收目标条带。使用公 司 建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过 定量和文库检测,合格后,使用 进行上机测序。统计学方法采用独立样本 检验。利用物种丰度表,使用 语言绘制组间物种菌落组成柱状图。采用 语言执行 秩和检验来分析 多样性,并使用 绘制 图。此外,使用 秩检验对差异菌群的丰度进行相关性分析,探究肠道菌群与临床病情评分的潜在关联性。结果 样本测序数据分析 研究组与对照组 韦恩图分析:份粪便样品共得到 条序列,最终形成 个,研究
6、组与对照组共有 个,研究组特有 个,对照组特有 个(见图)。肠道微生物 多样性分析 组的稀释曲线趋向平坦,表明所选定的测序深度可以满足研究需要,继续增加数据量只会导致很少数的新物种被检测到(见图)。多样性指标用于表征样品内的微生物群落多样性。反映群落丰富度的、和 指 数,以 及 反 映 群 落 多 样 性 的 和 指数,研究组均低于对照组,差异均有统计学意义()。研究组比对照组的肠道菌群群落丰富度和多样性均发生了一定变化()(见表)。表 多样性参数的比较分组研究组 对照组 示 值 肠道微生物 多样性分析 通过 分析提取数据中最主要的信息,即最能反映样品差异变化的信息,并绘制二维坐标图,横坐标(
7、)与纵坐标()分别代表影响群落组成的 组因素,百分比代表对样品差异的贡献值,各组样本分布有一定的集中趋势又存在一定的离散趋势(见图),说明不同组别之间是有差异的,存在自己独有的和不同的组间相似的肠道菌群结构,同一组内分离可能是影响个体肠道群落组成的因素较多。检验在门水平上,拟杆菌门()在 黄 褐 斑 病 人 中 相 对 丰 度 较 低;厚 壁 菌 门()、放射菌门()在黄褐斑病人中相对丰度较高(见图)。在纲水平上,拟杆菌纲()、厚壁菌纲()在黄褐斑病人中相对丰度较低;芽孢杆菌纲()、放线菌纲()在黄褐斑病人中相对丰度较高(见图)。蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 在目水平上,拟杆菌目()在黄
8、褐斑病人中相对丰度较低;乳杆菌目()、双歧杆菌目()在黄褐斑病人中相对丰度较高(见图)。在科水平上,普雷沃菌科()、拟杆菌科()在黄褐斑病人中相对丰度较低;毛 螺 菌 科()、乳 杆 菌 科()、双歧杆菌科()在黄褐斑病人中相对丰度较高(见图)。在属水平上,普雷沃氏菌()、拟杆菌属()在黄褐斑病人中相对丰度较低;布劳特氏菌()、乳酸杆菌属()、双歧杆菌属()在黄褐斑病人中相对丰度较高(见图)。讨论 本研究利用 测序方法对 例成年黄褐斑与 名成年健康对照组的肠道细菌群 基因 区进行测序分析,研究组与对照组共拥有 个相同,物种组成多样性分析结果显示,对于肠道微生物 多样性结果显示,研究组均低于对照
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