基于体外实验对牡荆素的结肠炎调控机制的研究_罗磊.pdf
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1、第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目:国家重点研发计划课题(2022YFF1100104);国家重点研发计划课题(2022YFF1100102)。作者简介:罗磊(1997),男,硕士研究生,研究方向:食品营养与健康。E-mail:。*通信作者:李森(1982),女,博士,副教授,硕士研究生导师,主要从事食品营养与健康的教学与科研工作,重点围绕食品中活性因子的营养健康功能、食品营养因子在预防老年痴呆、肠炎等慢性疾病方面的作用及机制等开展相关研究工作。E-mail:。管骁(1979),男,博士,教授,博士生导师,主要从事粮油食品加工与营养领域的科研教学工作,重点围绕粮油加工与营养、现代生物技术
2、在粮油资源开发中的应用等研究。E-mail:。基于体外实验对牡荆素的结肠炎调控机制的研究罗磊,王硕,蔡毓玮,张妤,李森*,管骁*上海理工大学健康科学与工程学院,上海 200093摘要:牡荆素是从牡荆叶子中提取出的一种天然化合物,具有多种生物活性。经研究发现牡荆素对结肠炎具有良好的调控作用,但其具体机制还有待深入探讨。文章通过建立 LPS 诱导的 Caco-2细胞体外结肠炎模型研究牡荆素对肠上皮细胞炎症的直接调控作用机制;通过研究结肠炎患者粪便的体外发酵探讨牡荆素对肠道菌群的调控作用。细胞实验结果表明牡荆素下调了 LPS 导致炎症因子 TNF-和 IL-1 的表达升高,提高了紧密连接蛋白 Occ
3、ludin 的表达水平,并通过抑制 TLR4/MYD88/NF-B 炎症信号通路的激活发挥抑制炎症作用;体外发酵实验结果表明,牡荆素处理改善了结肠炎患者肠道菌群结构,降低了有害菌 Escherichia-Shigella、Enterococcus 和 Clostridioides 的丰度。综上所述,牡荆素可以通过抑制肠上皮细胞 TLR4/MYD88/NF-B 炎症信号通路的激活和调节肠道菌群发挥结肠炎调控作用。关键词:牡荆素;结肠炎;体外发酵;肠道菌群;TLR4/MYD88/NF-B 信号通路doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.023第 53 卷第 3 期
4、2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023溃疡性结肠炎(UC)作为一种慢性非特异性炎症性肠道疾病,是炎症性肠病(IBD)的一种代表类型,至今病因不明,推测可能与免疫因素和肠道菌群之间的复杂关系有关,通过削弱肠道屏障导致肠道免疫的不适当激活1。近年来,UC 的发病率逐渐升高,已经成为一种全球性疾病。临床上,UC 以腹泻、腹痛、血便和体重减轻等为主要特征,存在较高的癌变风险,可能导致结肠癌病发2。现有的治疗手段以氨基水杨酸盐和皮质类固醇等药物或手术治疗为主,但存在复发几率较大、可能引起多种副作用等问题3。深入了解溃疡性结肠炎的
5、发病机制,减少复发性炎症并实现长期缓解,寻找有效且副作用低的治疗药物,如功能食品和生物活性化合物,既是当前研究的热点,也是医学领域亟待解决的问题。肠道是人体最大的器官,其内环境的稳定与机体健康密切相关。肠道内稳态的平衡依赖于定殖肠道的微生物群、宿主免疫系统和肠上皮之间复杂的相互作用,多种调节机制共同发挥作用维持肠道内稳态,内稳态一旦被破坏就会导致如炎症性肠病等肠道疾病的产生4。肠道微生物对于维持机体健康具有重要作用,宿主和肠道微生物之间是一种共生的关系:一方面,宿主的饮食、遗传、年龄和服用抗生素等因素都可以改变肠道微生物的组成和功能5;另一方面,肠道微生物参与机体的物质和营养代谢,维持人体生理
6、的正常功能,其失衡会引发炎症性肠病、肥胖和肠癌等疾病6。调节肠道微生物可以保障机体健康,预防或治疗疾病。研究发现,摄入膳食多酚能够显著调节肠道菌群的结构和功能,增加有益菌的丰度,减少有害菌的丰度并促使菌群产生有益短链脂肪酸维持肠道内稳态,同时多酚在结肠中可74-第 3 期第 53 卷罗磊等:基于体外实验对牡荆素的结肠炎调控机制的研究以被肠道菌群利用生成活性更高的代谢产物,从而改善 IBD7。牡荆素是天然的黄酮类化合物,也是小米多酚中主要的活性成分之一,凭借其广泛的药理作用受到了越来越多的关注,表现出优异的益生作用和抗炎能力8。有研究发现牡荆素可以减少受刺激 RAW264.7 细胞的抗肿瘤坏死因
7、子-(TNF-)、抗白细胞介素-1(IL-1)和一氧化氮(NO)的释放9。Duan 等利用小鼠模型发现牡荆素可以通过抑制肝脏细胞 TLR4/NF-B 信号通路的激活,对结肠炎所致的肝损伤起到修护作用10,但其对肠道炎症的调控机制不明。同时有研究发现牡荆素治疗减轻了结肠炎小鼠的炎症、增强了肠屏障功能,并改善了肠道菌群失调11。本研究在前期也发现牡荆素在小鼠体内可以通过调节肠道菌群的组成和丰度,减轻由高脂饮食诱导的氧化应激和炎症反应12。然而,小鼠和人体肠道菌群组成不同,共同菌种较少13,因此牡荆素对人体肠道菌群的调控作用有待进一步研究。本研究采用脂多糖(LPS)诱导的 Caco-2 细胞体外结肠
8、炎模型探究牡荆素对肠上皮细胞炎症的调控机制,并通过牡荆素与结肠炎患者肠道菌群的体外发酵,验证牡荆素对结肠炎患者肠道菌群的调控作用,为进一步探讨牡荆素作为预防和治疗结肠炎的活性物质提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂牡荆素标品(纯度98%)购于上海源叶生物科技有限公司;LPS(L2880)购于 Sigma 公司;DMEM培养基和胎牛血清购于 Gibco 公司;双抗(青霉素和链霉素)、Hank s 和胰酶购于上海生工生物工程股份有限公司;Caco-2 细胞购于中国科学院上海细胞库;CCK-8 试剂盒、Western blot 及 IP 裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒、BeyoColorTM彩色预染
9、蛋白分子量标准(10-170kD)和抗体(-actin、IL-1、TNF-、Occludin、NF-B、pNF-B、IB-、pIB-)购于上海碧云天生物科技有限公司;DNA 抽提试剂盒(E.Z.N.A.Soil DNA Kit)购于美国 MP Biomedicals 公司;FastPfu Polymerase 购于中国 TransGen 公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 购于美国 Axygen公司;建库试剂盒(NEXTflwxTM Rapid DNA-SeqKit)购于美国 Bioo Scientific 生物技术公司;测序试剂盒(MiSeq Reagent
10、Kit)购于美国 Illumina 公司;结肠炎患者粪便由上海健康医学院的十位志愿者提供,其均已知情并同意研究。1.2设备与仪器Synergy HTX 型多功能酶标仪购于美国 Berten公司;DYY-6C 型电泳仪购于北京六一生物科技有限公司;ChemiDocTM Imaging System 型凝胶成像系统购于美国 BIO-RAD 公司;CO2培养箱购于 PHCbi公司;Eppendorf 5424R 型高速冷冻离心机购于美国ALPHA 公司;BSC-1300IIA2 型超净台购于江苏净化设备有限公司;HWS12 型电热恒温水浴锅购于上海一恒科学仪器有限公司;LDZMM-60L-II 立式
11、高压蒸汽灭菌器购于上海申安医疗器械厂;测序仪Illumina Miseq 购于美国 Illumina 公司;磁力架购于上海生工生物工程股份有限公司;ABI GeneAmp9700 型 PCR 仪购于美国 ABI 公司;ME204E 型电子天平购于赛多利斯科学仪器有限公司;LAI-22 型厌氧工作站购于上海龙跃仪器设备有限公司。1.3实验方法1.3.1细胞培养 Caco-2细胞复苏后接种在含有 10%胎牛血清(FBS)、88%的 DMEM 培养基、1%非必需氨基酸和 1%双抗(100 mg/L 链霉素和 100 mg/L 青霉素)的完全培养基上,并将细胞培养在 37、5%CO2及 95%空气湿度
12、的培养箱中,后续选择对数期的细胞用于实验。1.3.2牡荆素对细胞活力的影响在 96 孔板中加入 100 L 的 Caco-2 细胞培养基,每孔细胞数约为 1105个,待细胞完全贴壁后,弃去培养液,加入现配的不同浓度牡荆素(0、25、50、100、200、400 g/mL)溶液。在培养箱中培养 12 h后,每孔加入 10 L 的 CCK-8 溶液,放入培养箱中孵育 1.5 h 后,用酶标仪测量每孔在 450 nm 处的吸光度,以确定牡荆素对细胞的毒性。每组设置六个平行实验组。1.3.3 Western blot 分析 Caco-2 细胞中蛋白的表达情况细胞实验分为空白对照组(C)、20 g/mL
13、 的LPS 造模组(LPS)14和先加入 100 g/mL 牡荆素再75-第 3 期第 53 卷工业微生物加入 20 g/mL 的 LPS 的处理组(V)。具体步骤如下:当培养瓶中 Caco-2 细胞长至 80%左右时,将细胞接种到 6 孔板中;待细胞完全贴壁后,弃去培养液,用 Hank s 缓冲液清洗,加入 2 mL 浓度为 100g/mL 的牡荆素溶液;孵育 12 h 后,再加入 LPS 溶液,使 LPS 的浓度为 20 g/mL;孵育 24 h 后,弃去细胞培养液,并用 Hank s 缓冲液清洗三遍。在冰上用 Western blot 和 IP 裂解液提取细胞蛋白,用 BCA试剂盒测定蛋
14、白浓度,并调平。目标蛋白采用 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用湿转法将条带转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用 5%脱脂奶粉封闭 2h,并在 4 下分别孵育一抗(11 000)过夜后,用TBST 缓冲溶液漂洗四次,一次 15min。漂洗结束后,与相应二抗(110 000)孵育 2 h,再用 TBST 缓冲液漂洗三次,一次 10 min。采用 ECL 法显色,选择的内参蛋白为-actin,用 Image J 软件读取目的蛋白的灰度值进行定量分析。1.3.4结肠炎病人粪便体外发酵碳酸-磷酸盐缓冲液的制备。碳酸-磷酸盐缓冲液的配制参照 Chen 等15的方法并稍作修改:缓冲液中 含 NaHCO32
15、.00 g/L,Na2HPO43.542 g/L,NaCl0.470 g/L,KCl 0.450 g/L,尿 素 0.400 g/L,CaCl22H2O 0.072 8 g/L,Na2SO40.227 g/L,MgCl2 6H2O0.100 g/L,蛋白胨 2.00 g/L,酵母提取物 2.00 g/L,还含有 10.00 mL/L 微量元素,其微量元素中含 FeSO47H2O 3 680 mg/L,MnSO4 H2O 1 159 mg/L,ZnSO47H2O 440 mg/L,CoCl2 6H2O 120 mg/L,CuSO4 5H2O98 mg/L,Mo7(NH4)6O24 4H2O 17
16、.4 mg/L,将缓冲液pH 调至 7.00,并在 121 C 下高压蒸汽灭菌 20 min。粪便滤液制备:取相同质量的结肠炎患者粪便混匀,将结肠炎患者的粪便与碳酸-磷酸盐缓冲液按 120(W/V)的比例混合,震荡均匀,并用四层无菌纱布过滤。收集滤液并立即放入厌氧环境中(90%氮,5%一氧化碳,5%氢)16。体外发酵:将 4 mL 粪便滤液和 16 mL 碳酸-磷酸盐缓冲液加入 50 mL 发酵瓶中混合均匀。将发酵瓶分为两组,分别是结肠炎患者粪便滤液发酵对照组(C)和牡荆素处理组(V),浓度为 0.5 mg/mL。在发酵 24 h 后分别取 2 mL 发酵液进行微生物分析。每组设置三个平行实验
17、组。1.3.5样品总 DNA 提取和 PCR 扩增按照 DNA 提取试剂盒的说明书提取微生物菌群的总 DNA,采用 1%琼脂糖凝胶电泳检验 DNA 抽提的完整性与质量,电压 5 V/cm,时间 20 min,用Nano Drop 2000 检测 DNA 的纯度和浓度。用(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)338F 和 806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)PCR 扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域。扩增程序如下:预变性为 95、3 min,30 个循环(95 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 30 s),72 稳定延伸 1
18、0min,放于 4 环境中保存。PCR 的具体反应体系为:5TransStart FastPfu buffer(4 L),2 L 2.5 mMdNTPs,0.8 L 下游引物(5 M),0.8 L 上游引物(55 M),0.4 L Trans-Start Fast Pfu DNA 聚合酶、10 ng 模板 DNA,并用 ddH2O 将体系补至 20 L。每个样品重复 3 次 PCR,将三次 PCR 产物混合。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物,并从 2%琼脂糖凝胶中提取 PCR 产物,用 AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒纯化,并用荧光计 QuantusTMFluorometer 进行定量。对
19、照样本的测序要求,将样本进行相应比例的混合。1.3.6构建 PE 文库及 Illumina 测序建库分析采用 NEXTflexTM Rapid DNA-SeqKit(Bioo Scientific,美国)来进行,其流程如下:链接接头;接头的自连片段使用磁珠筛去除;富集文库模板采用 PCR 扩增;磁珠回收 PCR 的产物得到最终文库。选用 Illumina 公司的 Miseq PE300/NovaSeqPE250 平台进行测序及分析(上海美吉生物医药科技有限公司)。1.3.7统计学分析利用软件 Graph Pad Prism 8.0.2(San Diego,CA,USA)进行画图,多组之间用单因
20、素方差分析进行显著性分析,P0.05 表示两组之间的差异具有统计学意义。2 结果2.1牡荆素对 Caco-2 细胞活力的影响由不同浓度的牡荆素处理 12 h 后,对 Caco-2细胞进行细胞活力检测,结果如图 1 所示。与对照组相比,经 25400 g/mL 的牡荆素处理后,Caco-2 细76-第 3 期第 53 卷胞的细胞活力没有明显下降,说明牡荆素在 25400g/mL 范围内对细胞无显著毒性,因此后续实验将100 g/mL 作为牡荆素的工作浓度。图 1不同浓度牡荆素对 Caco-2 细胞活力的影响注:*表示 P0.05,*表示 P0.01,*表示 P0.001。2.2牡荆素对炎症因子和
21、屏障蛋白表达的影响为了研究牡荆素对 LPS 诱导的 Caco-2 细胞炎症模型中炎症因子和屏障蛋白的影响,本研究采用免疫印迹检测分析了炎症因子 TNF-、IL-1 和屏障蛋白 Occludin 的蛋白表达水平。如图 2 所示,与对照组相比,LPS 诱导后的 Caco-2 细胞中 TNF-和 IL-1 的表达明显升高,Occludin 的表达明显降低,而牡荆素处理显著降低了 TNF-和 IL-1 的表达,上调了 Occludin 的表达。该结果表明牡荆素可以通过下调炎症因子表达、提高屏障蛋白表达,减轻由 LPS 诱导的细胞炎症,改善肠上皮屏障损伤。2.3牡荆素对 TLR4/MYD88/NF-B
22、信号通路的影响核因子(NF)B 是一种转录因子,控制多种调节炎症基因的转录17,可被 TLR4 等上游信号激活,而 TLR4/MYD88/NF-B 信号通路是重要的炎症调控通路。为了探讨牡荆素能否通过抑制该通路来抑制 LPS 诱导的 Caco-2 细胞炎症,本研究检测了该图 2牡荆素对炎症因子和肠屏障蛋白表达的影响注:*表示 P0.05,*表示 P0.01,*表示 P0.001。(a)Westernblot 检测-actin、TNF-、IL-1 和 Occludin 蛋白的表达;(b)TNF-定量分析;(c)IL-1定量分析;(d)Occludin 定量分析。罗磊等:基于体外实验对牡荆素的结肠
23、炎调控机制的研究1.51.00.50.00255010020040015010050002550 100 200 400浓度/(g mL-1)LPSVC-actinTNF-IL-1OccludinaCLPSVCLPSV1.51.00.50.0CLPSVCLPSVCLPSVCLPSV1.51.00.50.0dcb77-第 3 期第 53 卷工业微生物CLPSVLPSVC-actinNF-bpNF-BIB-pIB-MYD88a信号通路的关键因子 MYD88、NF-B/pNF-B 和IB-/pIB-蛋白的表达。如图 3 所示,与空白对照组相比,LPS 诱导后 Caco-2 细胞的 MYD88 蛋白表
24、达水平、NF-B 和 IB-的磷酸化水平(pNF-B,pIB-)均显著升高,提示 TLR4/MYD88/NF-B信号通路的激活;而经牡荆素处理后,MYD88 的表达水平、NF-B 和 IB-的磷酸化水平均显著下降,表明牡荆素可以通过抑制 TLR4/MYD88/NF-B信号通路的激活抑制细胞炎症。2.4牡荆素体外发酵后结肠炎患者肠道微生物的变化为进一步探究牡荆素对结肠炎患者肠道菌群的调节作用,本研究将牡荆素与结肠炎患者粪便样品进行体外厌氧发酵,并利用 16 S rRNA 基因测序技术分析结肠炎患者肠道菌群的变化。如图 4 所示,根据主坐标分析(Principal Co-ordinates Ana
25、lysis)结果,对照组(C 组)和牡荆素处理组(V 组)的微生物区系明显分离(图 4a),表明两者菌群结果显著不同。维恩图(图 4b)显示两组共有的 OUT 数为 148,其中对照组独有的 OUT 数为 16,牡荆素处理组独有的 OUT 数为 5,说明牡荆素处理使肠道菌群结构发生了变化。为了进一步分析肠道菌群相对丰度的变化,在门水平上对微生物组成的分析(图 4c)显示,Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidota(拟杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)和 Fusobacteriota(梭杆菌门)为主要的菌门,经牡荆素处理后,Firmicutes、Bacteroid
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