金龙胆草醇提取物对慢性牙周炎的体外抑菌抗炎作用研究_陈海鹰.pdf
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1、2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2金龙胆草醇提取物对慢性牙周炎的体外抑菌抗炎作用研究*陈海鹰1,汪龙凤1,林清凡2,王伟德1,付东杰3(1.泉州医学高等专科学校口腔医学院,福建泉州362000;2.泉州医学高等专科学校科技中心,福建泉州362000;3.武汉大学人民医院,湖北武汉430000)摘要目的:探讨金龙胆草醇提取物对慢性牙周炎常见致病菌牙龈卟啉单胞菌(Pg)、具核梭杆菌(Fn)的体外抑菌效果,观察金龙胆草醇提取物对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)诱导人牙龈成纤维细胞(HGF)炎症反应的影响。方法:以乙醇为提取剂,采用索式提取法、热水浴浸提
2、法和超声辅助提取法对金龙胆草进行提取,冷冻干燥后计算提取率;使用滤纸片扩散法观察提取物对Pg、Fn的抑菌效果;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测金龙胆草醇提取物和Pg-LPS、HGF共同培养24 h、48 h对细胞增殖的影响;通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)、前列腺素E2(PGE2)分泌水平;应用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测HGF炎症模型中核因子-B(NF-B)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)蛋白表达水平,分析金龙胆草醇提取物对NF-B信号通路的抑制情况。结果:3种提取方式的金龙胆草提取率比较,超声辅助提
3、取法显著高于索式提取法和热水浴浸提法(P0.05);100、200、500、1 000 g/mL药液组HGF活性显著低于对照组(P0.05)。干预12、24 h后,Pg-LPS组HGF培养液上清液中TNF-、IL-1、PGE2水平均高于对照组(P0.05);干预12、24h后,Pg-LPS+20g/mL药液组、Pg-LPS+50 g/mL药液组TNF-水平均低于Pg-LPS组(P0.05);干预12 h后,Pg-LPS+10g/mL药液组、Pg-LPS+20g/mL药液组、Pg-LPS+50g/mL药液组IL-1水平均明显低于Pg-LPS组(P0.05);干预12、24 h后,Pg-LPS+1
4、0g/mL药液组、Pg-LPS+20 g/mL药液组、Pg-LPS+50 g/mL药液组PGE2水平均低于Pg-LPS组(P0.05)。干预12、24 h后,Pg-LPS组HGF中NF-B、MMP-1蛋白相对表达量均高于对照组(P0.05);干预12、24 h后,Pg-LPS+10 g/mL药液组、Pg-LPS+20 g/mL药液组、Pg-LPS+50 g/mL药液组NF-B、MMP-1蛋白相对表达量均低于Pg-LPS组(P0.05)。结论:金龙胆草醇提取物对Pg、Fn有一定的抑菌作用,索式提取法可提高抑菌效果;金龙胆草醇提取物可抑制Pg-LPS诱导HGF的TNF-、IL-1、PGE2分泌,阻
5、断NF-B信号通路的激活,这可能是其发挥抗炎作用的机制之一。关键词慢性牙周炎;金龙胆草;醇提取物;牙龈卟啉单胞菌;体外抑菌;牙龈卟啉单胞菌脂多糖;牙龈成纤维细胞;炎症;NF-B中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X(2023)02-0028-07DOI:10.13862/43-1446/r.2023.02.006Study on the Antibacterial and Anti-inflammatory Effects of Conyza Blinii Lvl.Ethanol Extract on Chronic Periodontitis In VitroCHEN
6、Haiying1,WANG Longfeng1,LIN Qingfan2,WANG Weide1,FU Dongjie3(1.School of Stomatology,Quanzhou Medical College,Quanzhou Fujian 362000,China;2.Science and Technology Center,Quanzhou Medical College,Quanzhou Fujian 362000,China;3.Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan Hubei 430000,China)AbstractObje
7、ctive:To explore the in vitro antibacterial effect of Conyza blinii Lvl.ethanol extract onporphyromonas gingivalis(Pg)and fusobacterium nucleatum(Fn),and to observe the effects of Conyza blinii Lvl.ethanol extract on the inflammatory response of human gingival fibroblasts(HGF)induced by Porphyromona
8、s gingivallipopolysaccharide(Pg-LPS).Methods:Conyza blinii Lvl.was extracted by soxhlet extraction,hot water bath引用:陈海鹰,汪龙凤,林清凡,王伟德,付东杰.金龙胆草醇提取物对慢性牙周炎的体外抑菌抗炎作用研究J.中医药导报,2023,29(2):28-34.*基金项目:泉州市科技计划项目(2018Z172);泉州医学高等专科学校校级重点科技项目(XJK2001A)282023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2牙周炎是一种由病原微生物引起、多种因素
9、共同作用,累及并破坏牙周组织的慢性炎症性疾病1。该病是引起我国成年人牙体缺失的首要原因。在牙周炎发展过程中,菌斑微生物能通过脂多糖、蛋白酶、菌毛等毒力因子发挥致病作用并介导牙周组织产生免疫炎症反应,导致牙周组织的持久破坏2。常见牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)等3细菌的胞壁脂多糖是一种高度活性的致病物质,可通过激活炎症通路,启动IL-1、TNF-、PGE2等促炎因子的表达,引起宿主免疫炎症反应4。人牙龈成纤维细胞(human gingivalfibroblast,HGF)作为牙
10、周支持组织的重要组成部分,具有合成、降解胶原蛋白的功能,可参与牙周组织的再生、修复和局部炎症反应,促进细胞炎症因子产生5。炎症因子可刺激基质金属蛋白酶(MMPs)的产生6,进而促进胶原蛋白降解,引起牙周组织的破坏。MMP-1为成纤维型胶原酶,在破坏牙龈胶原纤维中起关键作用,参与了牙周炎的进展7。因此,控制菌斑、抑制炎症介质和蛋白水解酶的产生对预防牙周病非常重要8。以牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激HGF等牙周组织细胞构建的细胞炎症模型,已在牙周炎相关研究中使用9。金龙胆草是一种传统道地中药材,为菊科植物苦蒿Conyzablinii Lvl.10的地上干燥部分。金龙胆草全草含萜类、生物碱
11、、皂苷、酚性物质、酸性物质、无机元素及微量的挥发油等成分11,其提取物具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等作用12-13。当前研究表明金龙胆草具有多种药理作用,对模型大鼠胃溃疡具有治疗作用14,并具有抑制宫颈癌(Hela)细胞和肺癌(SPC-A1)细胞增殖的作用15。已有研究表明金龙胆草提取液在体外对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有抑制作用16。金龙胆草常用于治疗以革兰氏阴性厌氧菌和兼性厌氧菌为主要致病微生物的口腔炎17,但尚未见相关研究。因此,本研究通过体外抑菌实验探讨金龙胆草醇提取物对慢性牙周炎常见致病菌Pg、Fn的抑菌效果,并观察其对Pg-LPS诱导HGF细胞炎症模型的体外抗炎作用,旨在为金龙胆草应
12、用于治疗慢性牙周炎提供实验依据。1材料1.1中药金龙胆草野生全草,2021年8月采于四川省米易县,经泉州科技平台泉州本草馆黄秀珍教授鉴定为金龙胆草extraction and ultrasonic-assisted extraction with ethanol as extraction agent.The extraction rate was calculatedafter freeze drying.The antibacterial effect of extract on Pg and Fn was observed by filter paper diffusionmethod.
13、Cell counting kit-8(CCK-8)was used to detect the effects of Conyza blinii Lvl.ethanol extract andPg-LPS co-cultured with HGF for 24h and 48h on cell proliferation.The secretion levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)and prostaglandin E2(PGE2)in cell culture supernatant were detect
14、ed by enzyme-linked immunosorbent assay.Western blotting was used to detect the expression of nuclear factor-b(NF-B)and matrix metalloproteinase-1(MMP-1)in HGF inflammatory model,and the inhibition of NF-B signalingpathway by Conyza blinii Lvl.ethanol extract was analyzed.Results:Compared with three
15、 extraction methods,ultrasonic-assisted extraction method was significantly higher than soxhle extraction method and hot water bathextraction method(P0.05),but theHGF activity in 100,200,500 and 1 000 g/mL groups were significantly lower than that in the control group(P0.05).After 12 and 24 h of int
16、ervention,the levels of TNF-,IL-1 and PGE2in HGF culture supernatantof Pg-LPS group were higher than those of control group(P0.05).After 12 and 24 h of intervention,the TNF-level in Pg-LPS+20 g/mL and Pg-LPS+50 g/mL groups were lower than that in Pg-LPS group(P0.05).After12 h of intervention,the IL-
17、1 level in Pg-LPS+10 g/mL,Pg-LPS+20 g/mL and Pg-LPS+50 g/mL groupswere significantly lower than that in Pg-LPS group(P0.05).After 12 and 24 h of intervention,PGE2levels inPg-LPS+10 g/mL,Pg-LPS+20 g/mL and Pg-LPS+50 g/mL groups were lower than those in Pg-LPS group(P0.05).After 12 and 24h of interven
18、tion,the relative expression levels of NF-B and MMP-1 in HGF of Pg-LPSgroup were higher than those of control group(P0.05).After 12 and 24 h of intervention,the relative expressionsof NF-B and MMP-1 in Pg-LPS+10 g/mL,Pg-LPS+20 g/mL and Pg-LPS+50 g/mL groups were lower thanthose in Pg-LPS group(P0.05
19、).Conclusion:The Conyza blinii Lvl.ethanol extract has certain antibacterial effecton Pg and Fn,and the soxhlet extraction can improve the antibacterial effect.The Conyza blinii Lvl.ethanolextract could inhibit the secretion of TNF-,IL-1 and PGE2in HGF induced by Pg-LPS,and block the activationof NF
20、-B signaling pathway,which may be one of the mechanisms of its anti-inflammatory effect.Keywordschronic periodontitis;conyza blinii Lvl.;ethanol extract;porphyromonas gingivalis;in vitroantibacterial;porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide;gingival fibroblasts;inflammation;NF-B292023年2月第29卷第2期Fe
21、bruary.2023 Vol.29 No.2(Conyza blinii Lvl.)。全草烘干粉碎后过60目筛,室温保存于密封袋备用。1.2菌株、细胞牙龈卟啉单胞菌Pg(编号:ATCCBAA-308,批号:20210315)、具核梭杆菌Fn(编号:ATCC10953,批号:20210706)购自广东省微生物菌种保藏中心;人牙龈成纤维细胞HGF(编号:BNCC357750,批号:2205110)购自商城北纳创联生物科技有限公司。1.3主要试剂胰酪大豆胨培养基TSA(批号:2107202)、TSB(批号:210902)均购自北京三药科技开发公司;Pg-LPS(批号:59164303)购自Invi
22、voGen公司;人白介素-1(IL-1)酶联免疫吸附测定试剂盒(批号:X4FR2E2SRE)、前列腺素E2(PGE2)酶联免疫吸附测定试剂盒(批号:X4FR2E5URT)和人肿瘤坏死因子-(TNF-)酶联免疫吸附测定试剂盒(批号:S4FR2T6TRU)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;PVDF膜(0.45 m)(批号:0000162999)购自EDM MillporeCorporation;彩色预染蛋白marker(批号:9623141421)、HRPGoat Anti-Rabbit IgG(H+L)(批号:9600014001)和HRP GoatAnti-Mouse IgG(H+L)(
23、批号:9300003001)均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。1.4主要仪器RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DLSB-5L/30低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司);HH S11-2S电热恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);HVA-50高压灭菌锅(日本Hirayama公司);YQX-厌氧培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);KQ5200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ChemiScope Touch6100荧光发光成
24、像仪(上海勤翔科学仪器有限公司);MultiskanFC酶标仪(美国Thermo Fisher公司);5840R高速低温离心机(美国Sigma公司)。2方法2.1中药提取称取金龙胆草粉末50 g,索式提取法以95%乙醇为提取剂,用95 水浴加热回流提取,直至提取管内的液体为无色为止,混合所有提取液;热水浴浸提法先加入95%乙醇溶液于70 恒温水浴锅中12 h浸提2次,第3次使用60%乙醇溶液于70 恒温水浴锅中10 h浸提,每次倒出提取液时用8层纱布过滤收集,混合所有提取液;超声辅助提取法参照热水浴浸提法,在每次倒出提取液前进行超声处理80 min(频率为40 MHz)。分别将收集的醇提取液于
25、冷冻离心机离心(5 000 r/min)10 min去除沉淀后,于65 旋转减压蒸发,直至冷凝器无液体滴出,得到浓缩液,-50 冷冻干燥,得到冻干样品,置于-20 密封保存,每种提取方法重复3次。2.2体外抑菌实验2.2.1滤纸片制备称取3种金龙胆草冻干粉各320 mg,加入100%的二甲基亚砜(DMSO)溶液200 L,超声震荡溶解后,加入无菌水,配置成含5%DMSO质量浓度为80 mg/mL的金龙胆草药液,将3种药液稀释成80、40、20、10 mg/mL,静置30 min,流通蒸汽121 灭菌15 min,于4 冰箱保存备用。取灭菌的10 mm滤纸片,浸泡于各种浓度梯度的药液,以及含5%
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