北京地区实验小鼠诺如病毒流行情况_刘芳妮.pdf
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1、DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.126实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)北京地区实验小鼠诺如病毒流行情况刘芳妮1,2,吕军苹2,3,柯跃华2,王长军1,2,郭金鹏2(1.中国医科大学公共卫生学院,辽宁110122;2.解放军疾病预防控制中心应急处置大队科室,北京 100071;3.中央民族大学药学院,北京 100081)摘要 目的调查北京地区19家生物公司自然条件下养殖的实验小鼠感染小鼠诺如病毒(mouse norovirus,MNV)的情况。方法从19家公司
2、生产的小鼠中随机抽取,每品种品系、每批次14只小鼠合为一笼,共计1 396笼19 544只小鼠。对每笼取粪便样本,采用TaqMan探针荧光定量PCR法,用MNV-1引物检测各品系小鼠感染MNV的情况,根据循环阈(cycle threshold,Ct)值判断小鼠是否被感染;采用卡方检验对5种小鼠粪便样本阳性率进行统计学差异性分析;将5种小鼠阳性样本的Ct值进行统计描述;采用非参数检验法对5种小鼠Ct值进行差异性分析。结果共检测粪便样本1 396份,BALB/c、C57BL/6、ICR、KM、BALB/c-nude小鼠的粪便MNV检出阳性率分别为17.65%、39.33%、10.57%、18.32
3、%和27.4%。C57BL/6小鼠的粪便MNV检出阳性率大于BALB/c、ICR、KM小鼠(P0.05),且BALB/c-nude小鼠的粪便MNV检出阳性率大于ICR、BALB/c小鼠(P0.05);BALB/c-nude小鼠和C57 BL/6小鼠的病毒载量总体上大于KM小鼠(P0.001,P0.05)。结论MNV-1引物可应用于小鼠MNV感染情况的检测;北京市5种实验小鼠MNV阳性率在10%40%,其中C57BL/6小鼠和BALB/c-nude小鼠的MNV阳性检出率较高。关键词 小鼠诺如病毒;TaqMan探针;荧光定量PCR;自然感染中图分类号 Q95-33 文献标志码 A 文章编号 167
4、4-5817(2023)02-0205-08Prevalence of Mouse Norovirus in Experimental Mice in BeijingLIU Fangni1,2,LU Junping2,3,KE Yuehua2,WANG Changjun1,2,GUO Jinpeng2(1.School of Public Health,China Medical University,Liaoning 110122,China;2.Emergency response brigade department,PLA Center for Disease Control and
5、Prevention,Beijing 100071,China;3.college of pharmacy,Minzu University of China,Beijing 100081,China)Correspondence to:GUO Jinpeng(ORCID:0000-0001-5966-4109),E-mail:ABSTRACT Objective To investigate the infection of mouse norovirus(MNV)in experimental mice raised under natural conditions from 19 bio
6、logical companies in Beijing.MethodsThe mice used in this study were randomly selected from mice produced by 19 companies,and 14 mice of each strain and batch were combined into one cage,totaling 1 396 cages of 19 544 mice.The fecal samples from BALB/c,C57BL/6,ICR,KM,and BALB/c-nude mice were collec
7、ted.TaqMan probe fluorescence quantitative PCR method was used to detect MNV infection of mice with MNV-1 primer,and whether the mice were infected with MNV was determined according to cycle threshold(Ct value).The chi-square test was used to analyze the difference of positive rate among the fecal s
8、amples from the five types of mice.The Ct values of the positive samples were statistically described;the non-parametric test was used to analyze the differences in Ct values among the five types of mice.Results A total of 1 396 fecal samples were collected.The positive rates of fecal MNV detection
9、in BALB/c,C57BL/6,ICR,KM,and BALB/c-nude mice were 17.65%,39.33%,10.57%,18.32%and 27.4%,respectively.According to the chi-square test results,the positive rate of fecal in C57BL/6 mice was higher than that in BALB/c,ICR,and KM mice(all P0.05),and the positive rate of BALB/c-nude mice was higher than
10、 that in ICR and BALB/c mice(P0.001,P0.05).The viral load of BALB/c-nude or C57BL/6 mice was generally greater than that of KM mice(P0.05).ConclusionMNV-1 实验动物质量控制 Quality Control of Laboratory Animals基金项目 军队后勤生物安全研究专项“生物样本多途径核酸及血清学调查技术研究”(2019T03901)第一作者 刘芳妮(1994),女,硕士研究生,研究方向:诺如病毒感染机制研究。E-mail:通信作
11、者 郭金鹏(1977),男,博士,副研究员,研究方向:军事预防医学。E-mail:。ORCID:0000-0001-5966-4109205实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)primers can be applied to the detection of MNV infection in mice.The positive rate of MNV in five types of experimental mice in Beijing ranges from 10%to 40%,among
12、which C57BL/6 mice and BALB/c-nude mice have higher positive rates of MNV than the others.Key words Mouse norovirus;TaqMan probe;Fluorescence quantitative PCR;Natural infection诺如病毒(noroviruses,NOV)是杯状病毒科的单股正链RNA病毒。杯状病毒科目前分为5个属:疱疹病毒属、兔出血症病毒属、纽布病毒属、札幌病毒属和诺如病毒属。杯状病毒为T=3的二十面体颗粒,含有180个主要衣壳蛋白;该病毒体积微小,无包膜,
13、大多由3个开放阅读框(open reading frames,ORF)构成;ORF大多包括ORF-1、ORF-2和ORF-3,可编码8 种病毒蛋白1-2。除 ORF-1、ORF-2 和 ORF-3 外,小鼠诺如病毒(murine noroviruses,MNV)额外包含ORF4。诺如病毒G和G是引起人类感染的主要病毒基因群,G和G进一步分为9和27个基因型,其中G.4病毒是大多数诺如病毒感染爆发的原因3-4。人诺如病毒(human noroviruses,HuNoV)流行范围广泛,各年龄组均可被感染,是地方性急性胃肠炎的主要病因,在全世界胃肠炎病例中占比高达20%5-6。此外,诺如病毒不断进化
14、,每24年产生新的毒株,并在全球范围内引起流行7-8。MNV是唯一一种在细胞培养和小动物模型中可复制的诺如病毒,可用于构建研究诺如病毒生物学和发病机制的小动物模型,同时MNV也是研究HuNoV的理想病毒模型9。研究表明,实验室鼠群体在正常屏障饲养环境下MNV感染率较高。经调查日本67.3%的普通级小鼠、39.1%的SPF级小鼠和62.5%的美国普通级小鼠感染了MNV,且商用SPF级 C57BL/6小鼠中也发现了20%的小鼠存在MNV抗体10。关于北美地区MNV的流行情况,有学者调查了 12 639 只小鼠,结果表明当地的MNV感染率为22.1%11。研究发现,MNV是小鼠群体中最为流行的病毒,
15、其总流行率(32%)比其他病毒高10倍以上12。近年来,有学者对我国各地实验MNV感染情况进行调查,发现广东地区实验小鼠的阳性率为 37.38%13,上海地区实验小鼠的阳性率为29.78%14,重庆地区实验小鼠高达 78%15等。此外,对36家国内机构送检的1 182份实验小鼠的血清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光法(IFA)联合进行MNV检测,发现阳性率高达42.2%16。本实验利用筛选得到的最佳引物 MNV-1,采用TaqMan探针荧光定量PCR法,对北京市19家生物公司生产的5种常用实验小鼠的MNV携带率进行了调查。本研究对了解北京市实验小鼠感染MNV情况以提高实验小鼠健康水
16、平,以及我国未来制定实验动物相关政策以控制生物公司小鼠MNV携带率提供参考;而且,本实验建立了成熟的TaqMan探针检测方法,可供相关实验动物部门和检测机构控制实验潜在性病毒影响提供技术参考和支持。现将调查结果报告如下。1材料与方法1.1小鼠粪便收集从北京19家生产实验小鼠的生物公司,抽取每品系、每批次14只小鼠合为一笼,对每笼小鼠垫料中的粪便进行随机收集,然后送至解放军疾病预防控制中心进行检测。共检测1 396笼,总共19 544只小鼠。5个品种品系小鼠及其数量分别是:BALB/c小鼠425笼,C57BL/6 小鼠 267 笼,ICR 小鼠 265 笼,KM 小鼠 202笼、BALB/c-n
17、ude 237笼。1.2主要试剂与仪器主要试剂包括病毒 RNA 提取试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量探针法试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,均购自天根生化科技(北京)有限公司;MNV质粒标准品由北京擎科生物技术有限公司合成,经过测序验证合格。仪器包括离心机(德国 Eppendorf AG 公司,型号5424R)、A2 生物安全柜(美国 Thermo 公司,型号1300 Series A2)、PCR 仪(美国 Thermo 公司,型号9700)、实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司,型号CFX96TM Touch)。1.3样本采集、处理
18、以及RNA提取用1.5 mL离心管在每笼小鼠的垫料中收集粪便,后根据收取的粪便量加入适量无RNA酶水,放置于冰盒中运输,尽可能对当天到达实验室的粪便样本进行RNA提取;若条件所限,也应将粪便储存在80,于样本到达一周内进行RNA提取。对所采集的1 396份小鼠粪便样本均采用一致的样本处理方法,处理过程:采用12 000 r/min的速度将装有样本的离心管离心5 min,取140 L样本上清液;按照病毒RNA提取试206实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)剂盒说明书,提取样本上清液中病毒总RNA;反转
19、录后,保存于20 冰箱备用。1.4引物和探针合成从GenBank获取MNV全基因组序列,根据MNV基因组中高度保守的区域,采用NCBI的Primer-Blast软件设计引物。共设计引物3对,根据引物的特异性、敏感性等选择了最佳引物MNV-1,上游引物P1序列为5-TCTGTYCTGCGCTGGGTC-3,下游引物P2序列为5-GCTGCGCCATCACTCATCC-3,探 针 序 列 为ATGCTGAGACCCCGCAGGAACG。普 通 PCR 引 物MNV-P-F2,上 游 引 物 序 列 为 5-ATGGTRGTCC-CACGCCAC-3,下游引物序列为 5-TGCGCCATCA-CTC
20、ATCC-3。以上引物及探针均由北京擎科生物科技有限公司合成。1.5反转录反应和PCR标准曲线的建立利 用 FastKing cDNA 第 一 链 合 成 试 剂 盒 和SuperReal荧光定量探针法试剂盒对病毒总RNA进行反转录反应。反转录反应的cDNA链合成需要按照第一链合成试剂盒说明书进行操作。反应体系为2 L 10King RT Buffer、1 L FastKing RT Enzyme Mix、2 L FQ-RT Primer Mix,5 L RNase-Free ddH2O,最后加入提取的 10 L 病毒 RNA 进行反转录。反应条件:42 孵育15 min,95 孵育3 min
21、,冷却至4 后放置于20 冰箱保存。建立PCR标准曲线:连续进行7次10倍梯度稀释,得到8个稀释度的MNV质粒标准品,范围为2.712 81022.712 8109拷贝/L,每个稀释度重复检测3次。反应体系包括:PreMix 12.5 L,正向、反向引物(10 mol/L)分别0.75 L,荧光探针0.5 L,DNA模板1 L。PCR反应条件:95 条件下预变性15 min,然后95 变性3 s,60 退火、延伸。采集40个循环的荧光,然后绘制质粒DNA在不同浓度下的循环阈(cycle threshold,Ct)值标准曲线。1.6TaqMan 荧光定量 PCR 法检测样本中的MNV病毒以抽检的
22、1 396份小鼠粪便样本中反转录合成的cDNA为模板,参照1.5节中荧光定量PCR实验步骤进行荧光定量PCR实验操作,检测样本中的MNV含量。结果判读:阳性样本结果的Ct值有数值出现,且其扩增曲线的起峰超过基线;阴性样本结果的Ct值为NA,未出现起峰或者起峰未超过基线。1.7TaqMan荧光定量PCR法进行MNV特异性检测采用1.5节方法,对12个已知病毒的RNA进行荧光定量PCR检测。12种病毒均来自解放军疾病预防控中心菌毒种库,需保存于80 冰箱,病毒分别为:ev71、MNV(NCBI编号HQ317203)、鼠肝炎病毒、冠状病毒 229e、脊髓灰质炎病毒、MNV(NCBI 编号:MF973
23、199)、柯萨奇病毒、埃可病毒、腺病毒、甲流病毒、乙流病毒、甲肝病毒。采用无RNA酶水作为阴性对照。1.8PCR产物测序及序列比较分析将抽检样本中的经荧光定量PCR检测,结果为阳性的20个小鼠粪便病毒RNA样本,进行普通PCR实验。PCR 反应体系:2T5 Super PCR Mix(Colony)12.5 L,上下游引物各 1 L,DNA 模板 1.5 L,无RNA 酶水 9 L,总反应体积为 25 L。反应程序:98 5 min;98 10 s,55 15 s,72 30 s,35 个循环;72 7 min。然后将PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司进行测序,通过NCBI网站的Blast
24、软件进行同源性核苷酸分析。1.9统计学方法采用SPSS 26.0统计学软件对以上检测结果进行统计分析。采用非参数Kruskal-Wallis检验对5个品种品系小鼠的Ct值进行差异性分析,若各类小鼠的Ct值分布存在差异,则再用Kruskal-Wallis检验的多重比较对各类小鼠Ct值进行差异性分析。使用卡方检验分析5个品种品系小鼠的MNV阳性检出率之间是否有差异,若5个品种品系小鼠的阳性检出率整体上存在差异,则需用卡方分割法进行组间两两比较,同时用Bofferoni法校正P值,最后得出检验结果。以P0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1MNV-1引物的PCR标准曲线以MNV-1为引物,8个稀
25、释度的MNV质粒标准品(2.712 81022.712 8109拷贝/L)为模板,进行荧光定量PCR实验;每个梯度进行3次重复。接着,以MNV质粒cDNA模板量的对数值(X)为标准曲线的横坐标,以荧光信号超过阈值时的Ct值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线。计算得到标准曲线方程为:Y=-3.445 8X+41.822。相关系数(r2)为 0.999,扩增效率 E=95%,提示标准曲线的重复性良好(图1)。207实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineApr.2023,43(2)2.2MNV特异性的PCR验证结果以MNV-1为引物,对12
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