kallistatin表达...障碍的关系及其初步机制研究_汪玉.pdf
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1、NJA中华男科学杂志National Journal of AndrologyZhonghua Nan Ke Xue Za Zhi2022,28(11):976 984http:/www androl cn论著Clinical esearch(临床研究)kallistatin 表达水平与男性生精功能障碍的关系及其初步机制研究汪玉,陈鑫月,尚坤,胥琴,李云秀,杜愿,转黎(昆明理工大学附属医院/云南省第一人民医院生殖医学科,云南 昆明 650032)【摘要】目的:探索 kallistatin 基因在男性生精功能中的作用及其可能的作用机制,为临床治疗生精功能障碍提供新的思路。方法:收集诊断为少精子症
2、、非梗阻性无精子症患者和正常男性的精液样本以及睾丸穿刺术后的睾丸组织。首先,检测患者精浆中 kallistatin 表达水平差异;然后,检测睾丸组织中 kallistatin、KLK1、B2、Bcl-2、casepase-3、Bax 等分子在 mNA 和蛋白水平的表达情况;其次,通过 Johnsen 评分观察睾丸生精功能、Masson 染色及天狼猩红染色检测睾丸组织间质纤维化水平;最后,通过相关性分析评价 kallistatin 表达水平与睾丸生精功能、细胞凋亡水平和组织纤维化的关系。结果:kallistatin 高表达于精浆和睾丸组织中,与正常男性相比,非梗阻性无精子症及少精子症患者精浆中的
3、 kallistatin 水平明显降低(P 0 05);少精子症组与非梗阻性无精子症组患者睾丸组织中 kallistatin、KLK1、B2 表达水平显著低于正常对照组(P 0 01),而正常组、少精子症组及非梗阻性无精子症组各组内 kallistatin、KLK1 两者表达未见明显差异(P 0 05)。少精子症及非梗阻性无精子症组患者睾丸组织中 Bcl-2 表达水平显著低于正常组(P 0 01),而 Bax 及 Casepase-3 表达水平明显高于正常组(P 0 01),凋亡水平与 kal-listatin 表达水平呈负相关趋势。Masson 染色和天狼猩红染色结果显示,非梗阻性无精子症及
4、少精子症患者睾丸组织中的纤维化水平及 I/III 型胶原纤维比例显著增加,非梗阻性无精子症组增加程度高于少精子症患者。结论:kallistatin 表达水平降低可能与睾丸生精功能障碍有关,并且其可能通过调控睾丸组织中细胞凋亡水平、纤维化水平对生精功能发挥调控作用,具体机制有待进一步研究证实。【关键词】kallistatin 基因;精子发生;生精功能障碍;男性不育症中图分类号:698文献标志码:Adoi:10 13263/j cnki nja 2022 11 003elationship of the kallistatin gene expression with male spermatog
5、enicdysfunction and its possible mechanismWANG Yu,CHEN Xin-yue,SHANG Kun,XU Qin,LI Yun-xiu,DU Yuan,ZHUAN LiDepartment of eproductive Medicine,The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology/TheFirst Peoples Hospital of Yunnan Province,Kunming,Yunnan 650032,China【Abstract】Obje
6、ctive:To explore the role of the kallistatin gene in male spermatogenesis and its possible mechanism,and pro-vide some new ideas for the clinical treatment of spermatogenic dysfunctionMethods:We collected semen samples from the patients679基金项目:国家自然科学基金项目(82260301,81460234,81760470,81660247);云南省生殖妇产疾
7、病临床医学中心 开放课题(2020LCZXKF-SZ01);云南省卫生健康委员会医学学科带头人培养计划项目(D-2019018,D-2017022);云南省卫生健康委员会医学学科后备人才培养计划项目(H-2017025);云南省科技计划项目-昆医联合专项 2017FE467(-155)作者简介:汪玉(1996-),女,云南昭通市人,硕士研究生,从事生殖医学与人类辅助生殖技术研究。陈鑫月(1997-),女,云南昆明市人,硕士研究生,从事生殖医学与人类辅助生殖技术研究。汪玉和陈鑫月对本研究有同等贡献,为共同第一作者。通讯作者:转黎,Email:zhuanli yunnan163 comwith o
8、ligospermia(OS)or non-obstructive azoospermia(NOAS)as well as testis tissue from testicular puncture We detected the dif-ferential expression of kallistatin in the seminal plasma and the mNA and protein expression levels of kallistatin,KLK1,B2,Bcl-2,casepase-3,Bax and other molecules in the testis t
9、issue,assessed the testicular spermatogenic function using Johnsens scores,exam-ined the interstitial fibrosis in the testis by Masson and Sirius staining,and analyzed the correlation of the expression level of kallistatinwith spermatogenesis,apoptosis and fibrosisesults:Kallistatin was highly expre
10、ssed in the seminal plasma and testis tissue Theexpression of kallistatin was significantly decreased in the seminal plasma(P 0 05)and so were those of kallistatin,KLK1 andB2 in the testis tissue of the NOAS and OS patients compared with those in the normal controls(P 0 01),but no statistically sig-
11、nificant difference was found between the expression levels of kallistatin and KLK1 within the same group(P 0 05)The expressionof Bcl-2 in the testis tissue was significantly lower(P 0 01)and those of Bax and Casepase-3 dramatically higher in the OS andNOAS patients than in the normal males(P 0 01)C
12、ell apoptosis was negatively correlated with the expression of kallistatin Theresults of Masson and Sirius staining showed that the fibrosis of the testis tissue and the ratio of type I/III collagen fibers were markedlyincreased in the OS and NOAS patients in comparison with the normal controls,even
13、 more significantly in the NOAS than in the OSgroupConclusion:Decreased expression of kallistatin may be related to spermatogenic dysfunction,and the kallistatin expressionplays a regulatory role in the testicular spermatogenesis,probably by regulating cell apoptosis and fibrosis in the testis tissu
14、e,but thespecific mechanism needs to be confirmed by further studies【Keywords】kallistatin gene;spermatogenesis;spermatogenic dysfunction;male infertilitySupported by grants from National Natural Science Foundation of China(82260301,81460234,81760470 and 81660247),Open Project of Yunnan Pro-vincial C
15、linical Medical Center of eproduction,Obstetrics and Gynecology(2020LCZXKF-SZ01),Training Program of Yunan Province Health Commis-sion for High-Level Medical Talents(D-2019018 and D-2017022),Training Program of Yunan Province Health Commission for eserve Medical Talents(H-2017025)and Joint Foundatio
16、n of Yunnan Provincial Science and Technology Program and Specialized Project of Kunming Medical University(2017FE467-155)Correspondence to:ZHUAN Li,email:zhuanli yunnan163 comeceived:May 27,2022;accepted:September 15,2022WHO 将不育症定义为男女双方有规律、无保护性生活 1 年后无法成功受孕1。大约 30%不育症是由男性因素导致的,不育症严重影响了 1/20 左右育龄期男性
17、(青春期至 40 岁)生殖健康2-3,其被认为是由遗传因素、有毒化学品和炎症因素及内分泌异常导致的精子参数异常4。研究表明,氧化应激通过调节生殖细胞自噬、衰老、凋亡、微血管生成和组织纤维化对精子发生进行调控5-6。组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)是一种独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂,是激肽释放酶 激肽系统(Kallikrein-kinin system,KKS)的重要成员之一,其广泛分布于心血管系统、肾脏、肝脏、子宫、前列腺和阴茎海绵体等组织器官以及血浆、精液、乳汁、羊水、尿液等体液中。kallistatin 由 kallistatin 基因进行编码,其通过活性中心和肝素结合结构域两
18、个结构域在血管舒张、氧化应激、细胞凋亡、细胞衰老、血管生成、组织纤维化、抗炎症和抗肿瘤等多种病理生理过程和信号通路中发挥多重生物学效应7。同属 KKS 的成员之一组织激肽释放酶 1(Kallikrein-1,KLK1)已被用于男性少精子症和弱精子症的临床治疗且已取得较好疗效,KLK1 通过激活细胞外信号调节酶 1/2(extracellular-regulatedkinase 1/2,EK1/2)通路和细胞周期蛋白 Cyclin A和 Cyclin E 促进精原干细胞增殖,从而促进精子发生8。在对机体其他系统的研究中,kallistatin 抗氧化应激的作用已初步展现,但尚无其在生精功能中的作
19、用研究。因此,本研究拟探索 kallistatin 在睾丸生精功能障碍中的作用及其可能的作用机制,为精子发生异常治疗提供新的思路或靶点。1资料与方法1 1主要实验材料实时荧光定量 PC 仪(Ther-mo 公司),垂直电泳槽(Bio-ad 公司),荧光显微镜(Nikon 公司),兔抗大鼠 kallisatatin 多克隆抗体(In-vitroqen,PA5-96636),HP 标记的羊抗兔 IgG(AB-clonal 公司),总 NA 提取试剂盒(TaKaa 公司),逆转录试剂盒、荧光定量 PC 试剂盒(Vazyme 公司),Human SEPINA4(kallistatin)ELISA Ki
20、t(Sig-ma 公司),计算机辅助精子分析系统(CASA)(SCASCOPE 公司),Masson 三色染色试剂盒(Solarbio 公司),兔抗大鼠 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 多克隆抗体(ABclonal 公司),Bouins 固定液(武汉赛维尔)。1 2研究对象及分组受试者为 2017 年 9 月至2020 年 1 月于云南省第一人民医院生殖医学科就诊的 20 45 岁男性不育症患者,此项研究获云南省第一人民医院人类研究和伦理委员会的批准,所有779中华男科学杂志2022 年 11 月第 28 卷 第 11 期Natl J Androl,Vol 28,No 11,Nov
21、ember 2022患者均对本研究签署知情同意书并同意参加。参照WHO 人类精液实验室检验手册(第五版),采用CASA系统进行精液分析,根据精子分析参数(精子浓度、前向运动精子百分率、正常精子形态百分率)分为正常组、少精子症组和无精子症组,无精子症再根据后续的生殖激素测定、精浆-葡萄糖苷酶测定、遗传学分析、睾丸穿刺活检等筛选出非梗阻性无精子症患者9:正常对照组(n=200,入组标准:精子浓度15 106/ml、快速前向运动精子百分率32%、正常形态精子百分第4%)。少精子症组(n=200,入组标准:精子浓度 15 106/ml,其余参数正常)。非梗阻性无精子症组(n=200,入组标准:3 次精
22、液 3 000 g 离心 15 min 沉渣中未见精子且通过病史、体格检查、生殖激素测定、精浆-葡萄糖苷酶测定、遗传学分析、睾丸穿刺活检等排除梗阻性无精子症)。1 3精浆样本收集所选受试者禁欲 2 7 d,手淫取精,置干燥无菌量杯内,37 水浴箱中孵育液化,并记录液化时间。采用 CASA 系统进行精液分析测定精子参数后,根据吸取 1 ml 精液样本于离心管中,并在 3 000 r/min 离心 15 min,重复离心 1 3次每次分别取上层液态精浆转移至冻存管中于80 冰箱中保存待测。1 4患者睾丸组织样本收集经伦理委员会的批准和患者知情同意,收集非梗阻性无精子症患者以及拟行 IVF/ICSI
23、 助孕但因女方取卵日因取精失败要求行睾丸穿刺取精术患者睾丸组织,根据前期精子分析参数分为正常对照组(n=60)、非梗阻性无精子症组(n=60)和少精子症组(n=60)。将收集的睾丸组织用生理盐水进行洗涤,然后一部分加入一定量的 Bouins 固定液放置于冻存管中固定进行组织学观察及分析。1 5ELISA 实验检测各组患者精液中 kallistatin基因蛋白表达。稀释并包被抗体蛋白,加封闭液37 水浴 1 5 h,洗涤 3 次拍干后加入待测样品并于37 水浴箱中温育1 5 h。再次洗涤后加入提前稀释好的生物素化抗体工作液,再次于37 水浴箱中温育 1 h。洗涤后加入显色底物,37 水浴箱中避光
24、反应 30 min,待标准品孔显色后加入 2 mol/L硫酸终止反应。将酶标板放置于酶标仪上,450 nm处测定每一孔 OD 值,做出标准曲线并计算样品密度。1 6实时荧光定量 PC(T-PC)将收集的各实验组睾丸组织使用 Tizol 提取总 NA 后,使用HiScript II Q T SuperMix for qPC 试剂盒将总NA 转化为 cDNA。使用 ChamQ Universal SYBqPC Master Mix 扩增 kallistain、KLK1、B2、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 基因(表 1)。扩增程序:预变性95 10 min;循环反应:95 2 min,
25、退火 60 30 s,40 个循环;融解曲线程序为 95 15 s,60 1 min。同时扩增管家基因-actin 以标准化样本NA 的量。基因转录水平的相对定量采用 ct法。表 1检测基因的引物序列Table 1 Primer sequences of the genes used for T-PCGenePrimer sequences-actinF:5-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3:5-GAGCTAAGAGCTGCCTGACG-3kallistatinF:5-CCGTGAGTAACCCCCTGAGA-3:5-ATGCTCAGCGGGGAGAAAAA-3KLK1F:5-CT
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