火龙果茎多糖对调节小鼠细胞免疫功能的研究及毒性评价.pdf
《火龙果茎多糖对调节小鼠细胞免疫功能的研究及毒性评价.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《火龙果茎多糖对调节小鼠细胞免疫功能的研究及毒性评价.pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、热带作物学报 2023,44(10):21262134 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-08-29;修回日期 2022-10-17 基金项目 海南省重点研发计划项目(No.ZDYF2022XDNY146,No.ZDYF2019107)。作者简介 梁秋杨(1999),男,硕士研究生,研究方向:功能食品。*通信作者(Corresponding author):白新鹏(BAI Xinpeng),E-mail:。火龙果茎多糖对调节小鼠细胞免疫功能的研究及毒性评价 梁秋杨1,白新鹏1,2*,李国胜1,常会敏1,朱恒伟1,桥振栓2,黄桂花3 1.海南
2、大学食品科学与工程学院/热带多糖资源利用教育部工程研究中心,海南海口 570228;2.海口植之素生物资源研究所有限公司,海南海口 570000;3.海南北纬十八度食品科学有限公司,海南东方 572633 摘 要:为了探究火龙果茎多糖(PSP)对环磷酰胺所致免疫低下小鼠细胞免疫功能的调节作用,本研究对火龙果茎多糖进行毒性评价,通过检测小鼠淋巴细胞在有丝分裂原诱导下的增殖能力,计算小鼠体重、脾指数、全脾免疫计数以及血细胞计数等来评价小鼠细胞的免疫功能。结果表明:PSP 对淋巴细胞存活率无抑制作用,PSP-1 和 5 倍浓度条件下的 PSP-2 对 T 淋巴细胞有相同的增殖效应,对 B 淋巴细胞无
3、明显影响;在免疫低下小鼠模型中,经 PSP 处理的小鼠脾指数和血细胞计数均有所缓解,且高剂量组效果较好,而对全脾免疫细胞的提升不明显。本研究表明,PSP-2 可能是PSP-1 中发挥免疫功能的活性组成成分,T 淋巴细胞为主要效应细胞,火龙果茎多糖发挥免疫功能主要是通过促进淋巴细胞增殖能力来实现的。关键词:火龙果茎多糖;小鼠;淋巴细胞;免疫功能;毒性评价 中图分类号:R285 文献标识码:A Toxicity Evaluation of Polysaccharides from Pitaya Stem on Regula-ting Cellular Immune Function in Mice
4、 LIANG Qiuyang1,BAI Xinpeng1,2*,LI Guosheng1,CHANG Huimin1,ZHU Hengwei1,QIAO Zhenshuan2,HUANG Guihua3 1.School of Food Science and Engineering,Hainan University/Engineering Research Center for Tropical Polysaccharide Resource Utilization,Ministry of Education,Haikou,Hainan 570228,China;2.Haikou Zhiz
5、hisu Biological Resources Research Institute Co.,Ltd.,Haikou,Hainan 570000,China;3.Hainan 18th North Latitude Food Science Co.,Ltd.,Dongfang,Hainan 572633,China Abstract:The aim of this study was to investigate the effects of pitaya stem polysaccharide(PSP)on the cellular im-mune function in mice wi
6、th cyclophosphamide induced immunodeficiency.In this study,the toxicity of pitaya stem polysaccharide was evaluated,and the immune function of mouse cells was evaluated by detecting the proliferation ability of mouse lymphocytes induced by mitogen,calculating the body weight,spleen index,spleen immu
7、ne count and blood cell count of mice.PSP had no inhibitory effect on the survival rate of lymphocytes.PSP-1 and PSP-2 had the same proliferation effect on T lymphocytes,but had no obvious effect on B lymphocytes.In the immunocompromised mouse model,the splenic index and blood cell count of mice tre
8、ated with PSP were alleviated,and the effect was better in the high-dose group,but the enhancement of whole splenic immune cells was not obvious.The results showed that PSP-2 may be the active component of PSP-1 to exert immune function,T lymphocytes are the main effector cells,and the immune functi
9、on of dragon fruit stem polysaccharide is mainly achieved by promoting lymphocyte proliferation.Keywords:pitaya stem polysaccharide;mice;lymphocyte;immune function;toxicity evaluation DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.10.024 火龙果(Hylocereus undatus)属仙人掌科多年生攀援植物,是一种营养丰富的热带经济水果,第 10 期 梁秋杨等:火龙果茎多糖对调节小鼠细
10、胞免疫功能的研究及毒性评价 2127 在我国台湾、广西、广东、海南以及福建等省(区)有较大规模种植面积1。火龙果根茎生长茂盛,为了保证果实品质,需要不断修剪枝条,加上果实采摘后产生的大量根茎,这些果茎如果仅作为废弃物处理,不但提高了火龙果生产加工成本,还导致环境污染2。因此,为提升火龙果的经济附加值,减少资源浪费,对火龙果茎进行开发利用具有重要意义。火龙果茎多糖(pitaya stem polysaccharide,PSP)作为天然活性多糖的一种,是火龙果茎的重要活性成分之一,具有抗氧化、调节肠道等生物功能,能够提高机体免疫力3。目前火龙果茎多糖的研究方向较多集中于提取、纯化以及抗氧化活性检测
11、。李国胜等4比较了 3 种多糖提取方法,其中亚临界水提取得率为 20.53%,远高于热水提取和超声辅助提取的得率,这一结果和马若影5用亚临界与微波辅助和超声微波协同提取比较得出的结论相似,说明亚临界水提取要比其他提取方法更高效;王超雪6利用超滤膜截留7和分子筛凝胶柱层析8纯化得到不同分子量的多糖成分,这些多糖组分浓度变化对其抗氧化活性影响较大。此外,有研究指出,利用火龙果茎多糖的生物活性应用于美容护肤上开发出的产品,具有一定的独特效果。唐雅园等9在制备护手霜时发现,添加火龙果茎多糖的护手霜,其 DPPH 自由基清除能力随着添加量的提高而显著增强,与未添加样品相比,护手霜的保湿率提高了 20%以
12、上,且添加多糖不会改变护手霜的稳定性,这是由多糖流变学性质所决定的。除以上研究外,对于火龙果茎多糖在机体免疫调节方面的研究尚未报道。植物多糖具有显著的免疫活性,能促使机体免疫器官正常生长,提升淋巴细胞增殖能力,通过调节红细胞免疫,影响蛋白质和抗体产生,从而影响机体免疫信息10-12。据研究表明,孙加燕等13研究发现玛咖多糖浓度在 0.110.0 mg/L 范围内能促进大鼠上皮细胞增殖,在 10.0 mg/L 浓度时能促进上皮细胞迁移,这一结果和 CHEN 等14研究得出的玛咖多糖具备调节机体免疫功能的观点基本一致。YIN 等15从海藻中提取的多糖具有调节机体肠道菌群和免疫应答等活性功能,刘红萍
13、等16研究发现,高剂量白芷多糖处理可增强免疫低下小鼠的先天免疫功能,也可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖。基于以上研究基础,本研究以 Balb/c 小鼠为实验动物,对火龙果茎多糖样品进行毒性评价,探究火龙果茎多糖对体外小鼠淋巴细胞增殖效应,及其对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠细胞免疫调节活性的影响,旨在明确火龙果茎多糖是否具有免疫调节活性,为火龙果茎多糖开发为功能产品提供一定参考依据。1 材料与方法 1.1 材料 新鲜火龙果茎由海南省东方市北纬十八度果业有限公司提供。实验动物:Balb/c 小鼠,雌性,55 只,每只1820 g。小鼠 SPF 环境饲养,正常供食供水(动物实验过程获得海南大学和海南医学院动
14、物伦理委员会的批准)。RPMI-1640 培养液:RPMI-1640(Gibco),NaHCO3;HEPES,丙酮酸钠 110,青霉素钠,硫酸链霉素,2-ME,胎牛血清(FBS)10%;磷酸盐缓冲生理盐水(PBS);红细胞裂解液:NH4Cl,KHCO3,EDTA(pH 7.6);环磷酰胺(cytoxan,CTX),江苏盛迪医药有限公司;刀豆球蛋白 A(concanavalin A,ConA)(Sigma);脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma);CCK-8 检测试剂盒(美仑生物)。1.2 方法 1.2.1 体外小鼠淋巴细胞增殖效应检测 (1)火龙果茎多糖制备与
15、配制。多糖制备:清洗干净的新鲜火龙果茎剖切去刺去芯,切成小块取 200 g,在 2.0 MPa,120 s 的条件下进行汽爆,汽爆后使用纱布分离固体残渣,8000 r/min 离心 15 min,除掉沉淀,通过旋蒸浓缩上清液至 1/4,按 4 倍体积 加 入 95%乙 醇 于 4 低 温 醇 沉,醇 沉 后6000 r/min 离心 10 min,取沉淀冻干,得到粗多糖 PSP-1,得率为 2.18%,PSP-1 中总糖含量为44.64%,按马若影5的多糖纯化方法,利用大孔树脂对 PSP-1 进行脱色除蛋白得到纯化多糖PSP-2,PSP-2 在 PSP-1 组分中约占 1/5。多糖配制:称取
16、33.8 mg PSP-1 加至 676 L二甲基亚砜(DMSO)中配成浓度为 50 mg/mL 的溶液,称取 6.9 mg PSP-2 加至 690 L DMSO 中配成浓度为 10 mg/mL 的溶液,二者均无法完全溶解,静置有棕黄色沉淀物质,通过涡旋和冰浴超声助溶后可以成为混悬状态,由于无法确定未溶2128 热带作物学报 第 44 卷 物的质量,故后续实验先混悬再吸取使用。在含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中将 PSP-1 多糖 DMSO 溶液配制成浓度为 200 g/mL,PSP-2多糖 DMSO 溶液配制成浓度为 40 g/mL,再用含10%胎牛血清的 RPMI-164
17、0 培养液将待测样品稀释至所需样品液浓度。因 PSP-2 在 PSP-1 组分中约占 1/5,故设置PSP-1 体外剂量为 PSP-2 的 5 倍,则最终 PSP-1的培养浓度为 50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.000 05 g/mL;PSP-2 的培养浓度为 10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 g/mL。显微镜下观察均未出现明显不溶物颗粒。(2)小鼠淋巴细胞的制备。脱脊椎处死 5 只Balb/c 小鼠,无菌环境下取脾脏进行破碎,过膜,于 4,1200 r/min 离心 5 min,离心沉淀加入红细胞裂解液约 1 mL,混匀,静置
18、30 s;加入 PBS,终止红裂,离心,循环 2 次;洗涤 2 次剩余细胞,用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞悬至 5 mL,对细胞样品进行活细胞计数,调节细胞浓度为 4106个/mL。(3)淋巴细胞增殖活性检测。对淋巴细胞毒性浓度排除。在 96 孔培养板中每孔加入 100 L各组细胞样品悬液,50 L 培养液,50 L 各浓度待测多糖培养液,总体积 200 L。每个样品设 4个复孔,另设 4 孔加培养液作为正常对照组,2孔无细胞等体积培养液作为本底空白对照。细胞于含 5%CO2的 37 培养箱中培养 48 h,培养结束前 12 h 每孔加入 10 L CCK-8 溶液。
19、测定时将标记的细胞样品用全波长酶标仪在 450 nm 处读取 OD 值,以正常对照组细胞生存率为 100%,空白对照组作为本底扣除,即 0%,计算待测样品组细胞生存比率。对 T、B 淋巴细胞增殖活性效应的评价。在 96 孔培养板中每孔加入 100 L 各组细胞样品悬液,50 L 有丝分裂原(ConA 终浓度 1 g/mL 或 LPS 终浓度 2 g/mL),50 L 各浓度待测多糖培养液,总体积 200 L。每个样品设4 个复孔,设 4 孔仅加有丝分裂原不加待测多糖培养液作为细胞增殖的阳性对照,另设 4 孔不加有丝分裂原作为细胞增殖的阴性对照。细胞于含5%CO2的 37 培养箱中培养 48 h
20、,培养结束前12 h 每孔加入 10 L CCK-8 溶液。测定时将标记的细胞样品用全波长酶标仪在 450 nm 处读取 OD值,以仅加有丝分裂原的阳性对照组细胞的增殖率为 100%,阴性对照组作为未增殖本底扣除,即0%,计算待测样品组细胞增殖比率。1.2.2 体内小鼠细胞免疫调控活性检测 (1)实验小鼠分组。准备 50 只 Balb/c 小鼠,其中,空白(正常)对照组 10 只,免疫低下模型对照组 10只,火龙果茎多糖低剂量组(125 mg/kg)10 只,火龙果茎多糖中剂量组(250 mg/kg)10 只,火龙果茎多糖高剂量组(500 mg/kg)10 只。(2)实验小鼠模型。小鼠随机分为
21、 5 组,每组 10 只,提前 1 周经胃给予小鼠多糖,以注射等体积生理盐水为空白对照组,其余组在第 1、4、7 天腹腔注射环磷酰胺 75 mg/kg。(3)多糖样品的配制与干预。用纯水溶解火龙果茎多糖受试样品,配制成所需干预浓度如下,分 别 对 应 样 品 干 预 的 低(125 mg/kg)、中(250 mg/kg)、高浓度(500 mg/kg)。低剂量组:125 mg/kg0.1 kg/mL=12.5 mg/mL;中剂量组:250 mg/kg0.1 kg/mL=25 mg/mL;高 剂 量 组:500 mg/kg0.1 kg/mL=50 mg/mL。CTX 造模前,各浓度组干预 1 周,
22、每组每天灌胃 0.1 mL/10 g。第 1 次 CTX 发作后,继续干预 10 d,第 10 天处死各组实验小鼠,评估干预效果。期间,空白对照组和模型对照组按相同方法灌胃纯水。(4)体重观测。自实验小鼠分组开始,每天监测每只实验小鼠的体重变化,并记录。(5)脾指数。在多糖干预终点,脱脊椎处死小鼠,无菌取脾脏,并对脏器质量称重,计算每只小鼠的脾指数。脾指数=脾脏质量/体重,单位为 mg/g。(6)全脾免疫细胞计数。在多糖样品的干预终点,参照 1.2.1-(2),计算每只小鼠的全脾免疫细胞的总数。(7)T、B 淋巴细胞增殖能力检测。将细胞样品的细胞浓度调至 4106个/mL。每个样品设 12个复
23、孔,另设 12 孔不加有丝分裂原作为细胞增殖的空白对照。参照 1.2.1-(3)检测 T、B 淋巴细胞在火龙果茎多糖作用后的淋巴细胞增殖比率。(8)血细胞计数。在体内实验终点,取各组小鼠全血,柠檬酸钠抗凝处理。经适当稀释后,用血细胞分析仪检测全血中白细胞、淋巴细胞、中间细胞、粒细胞、红细胞以及血小板等成分的数量。以每升血液中的血细胞数量表示。1.3 数据处理 所有实验结果均以均值SD 表示,数据均符第 10 期 梁秋杨等:火龙果茎多糖对调节小鼠细胞免疫功能的研究及毒性评价 2129 合正态分布,采用单因素方差分析。2 结果与分析 2.1 体外小鼠淋巴细胞增殖效应 2.1.1 对淋巴细胞毒性浓度
24、排除 脾脏淋巴细胞在无诱导条件下无增殖能力,可在无诱导培养条件下通过活细胞检测评价火龙果茎多糖是否对淋巴细胞具有毒性效应,或者可能的毒性浓度范围。结果如图 1,火龙果茎多糖样品在测试浓度范围内对活细胞均未表现出明显的细胞毒性效应,即在该浓度范围内火龙果茎多糖对脾脏淋巴细胞存活率均无抑制作用。PSP-1 在 0.5 g/mL 条件下具有一定增殖促进作用,但其他浓度条件下细胞存活率的变化不明显;PSP-2 在浓度范围内均呈明 显的促进增殖作用,并具有浓度依赖关系。这说明火龙果茎多糖,尤其是 PSP-2 可能具有诱导淋巴细胞增殖的效应。2.1.2 对 T 淋巴细胞增殖活性的影响 检测淋巴细胞增殖能力
25、是评价免疫功能最重要的指标,有丝分裂原 ConA 主要诱导 T 淋巴细胞增殖。结果如图 2,在有丝分裂原 ConA(1 g/mL)诱导的条件下,火龙果茎多糖在无毒性浓度范围内对 T淋巴细胞均表现出显著的增殖促进效应,并呈现一定的浓度依赖关系,PSP-1 和 PSP-2 多糖浓度分别为 50、10 g/mL 时的增殖效果最好,PSP-1 为PSP-2的5倍浓度的条件下,增殖促进作用与PSP-2相当。这说明纯化后的火龙果茎多糖 PSP-2 可能是PSP-1 促进免疫功能的主要效应成分。*表示与 CK 间差异显著(P0.05);*表示与 CK 间差异较显著(P0.01);*表示与 CK 间差异极显著
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 火龙果 多糖 调节 小鼠 细胞 免疫 功能 研究 毒性 评价
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。