基于NF-κB_NLRP3_caspase-1通路研究白及多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症损伤的保护作用.pdf
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1、邱波等 基于NF-B/NLRP3/caspase-1通路研究白及多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症损伤的保护作用 第 8 期基于 NF-B/NLRP3/caspase-1 通路研究白及多糖对溃疡性结肠炎大鼠 肠黏膜炎症损伤的保护作用邱波 曾永鸿 刘金海 袁志臻 刘荟娟(信阳职业技术学院,信阳 464000)中图分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2023)08-1623-05摘要 目的:探究白及多糖对溃疡性结肠炎(UC)大鼠核因子B(NF-B)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱天冬酶-1(caspase-1)通路蛋白表达及对肠道屏障损伤的影响
2、。方法:采用三硝基苯磺酸(TNBS)+乙醇法建立UC模型,并将SD大鼠随机分为空白组、模型组、白及多糖低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组、柳氮磺胺吡啶阳性组(0.67 g/kg),除空白组外,其余各组均建立UC模型。白及多糖低、中、高剂量组和阳性组分别灌胃给予相应剂量白及多糖和柳氮磺胺吡啶,空白组和模型组灌胃给予10 ml/kg生理盐水,各组大鼠连续给药2周,1次/d。末次给药12 h后,观察大鼠一般行为并对大鼠进行疾病活动指数(DAI)评分;取大鼠结肠组织,苏木精-伊红染色观察组织病理形态;ELISA检测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)、炎症因子
3、IL-1、肿瘤坏死因子-(TNF-)水平及肠道屏障功能受损指标二胺氧化酶(DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白(i-FABP)水平;Western blot检测结肠组织通路蛋白NF-B p65、磷酸化NF-B p65(p-NF-B p65)、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠形体消瘦、大便稀溏、结肠组织可见黏膜溃疡、充血、扩张及炎症细胞浸润等病理损伤,DAI评分、结肠组织MPO、IL-1及TNF-含量、p-NF-B p65/NF-B p65、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达均升高(P0.0
4、5),DAO和i-FABP含量均降低(P0.05)。与模型组比较,白及多糖各剂量组及柳氮磺胺吡啶组大鼠DAI评分、结肠组织病理损伤程度、MPO、IL-1及TNF-含量、p-NF-B p65/NF-B p65、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达均降低(P0.05),DAO和i-FABP含量均升高(P0.05)。结论:白及多糖可抑制NF-B/NLRP3/caspase-1通路激活,降低炎症反应和肠屏障损伤,改善UC症状和肠黏膜损伤。关键词 白及多糖;溃疡性结肠炎;核因子-B;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3;半胱天冬酶-1;肠道屏障损伤Study on p
5、rotective effect of Bletilla striata polysaccharide on intestinal mucosal inflammatory injury in rats with ulcerative colitis based on NF-B/NLRP3/caspase-1 pathwayQIU Bo,ZENG Yonghong,LIU Jinhai,YUAN Zhizhen,LIU Huijuan.Xinyang Vocational and Technical College,Xinyang 464000,ChinaAbstract Objective:
6、To investigate effects of Bletilla striata polysaccharide on expressions of nuclear factor kappa B(NF-B)/nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3(NLRP3)/caspase-1(caspase-1)pathway proteins and intestinal barrier damage in rats with ulcerative colitis(UC).Methods:UC model wa
7、s induced by trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)+ethanol,SD rats were randomly divided into:blank group,model group,Bletilla striata polysaccharide low(100 mg/kg),medium(200 mg/kg),high(400 mg/kg)doses groups and sulfasalazine positive group(0.67 g/kg),and model was established in all groups except
8、blank group.Bletilla striata polysaccharide low,middle,high groups and sulfasalazine group were given low,middle and high doses of Bletilla striata polysaccharide and sulfasalazine respectively by gavage,and rats in blank group and model group were administrated with 10 ml/kg saline by gavage for 2
9、weeks,once a day,and 12 hours after the last administration,general behavior of rats was observed and disease activity index(DAI)was scored;colonic tissues of rats were taken and histopathology was observed by hematoxylin-eosin staining;levels of myeloperoxidase(MPO),IL-1,tumor necrosis factor-(TNF-
10、),damage indexes of intestinal barrier function:diamine oxidase(DAO)and intestinal fatty acid binding protein(i-FABP)were detected by ELISA;Western blot was used to detect expressions of NF-B,phosphorylated NF-B p65(p-NF-B p65),NLRP3,caspase-1 and cleaved caspase-1 proteins in colonic tissues.Result
11、s:Compared with blank group,rats in model group were emaciated,had loose stool,with pathological damages such as mucosal ulcer,hyperemia,dilatation and inflammatory cell infiltration,DAI score,contents of MPO,IL-1 and TNF-,protein expressions of NF-B,p-NF-B p65,NLRP3,caspase-1 and cleaved caspase-1
12、were all increased(P0.05),and contents of DAO and i-FABP were decreased(P0.05).Compared with model group,DAI score,degree of pathological damage of colon tissue,contents doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.011作者简介:邱 波,男,讲师,主要从事基础医学研究。1623中国免疫学杂志2023 年第 39 卷of MPO,IL-1 and TNF-,p-NF-B p65/NF-B p65,N
13、LRP3,caspase-1 and cleaved caspase-1 protein expressions were all decreased(P0.05),and contents of DAO and i-FABP were increased(P0.05).Conclusion:Bletilla striata polysaccharides can inhibit activation of NF-B/NLRP3/caspase-1 pathway,reduce inflammation and intestinal barrier damage,and improve UC
14、symptoms and intestinal mucosal damage.Key words Bletilla striata polysaccharide;Ulcerative colitis;Nuclear factor-kappa B;Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3;caspase-1;Intestinal barrier damage溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是临床常见的结肠或直肠慢性炎症性疾病,其发病机制复杂,且易反复,威胁患者生命健康1-2。研究发
15、现,炎症反应和肠道黏膜屏障损伤参与UC病理学发展过程3-4。而核因子-B(nuclear factor-kappa B,NF-B)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱天冬酶-1(caspase-1)信号通路可诱导白细胞与内皮细胞黏附,参与调控炎症反应5-6。白及多糖是从中药白及块茎中提取分离的一种新型葡甘露聚糖,研究发现其对UC具有较好的治疗作用7。但白及多糖对 UC 过程中 NF-B/NLRP3/caspase-1通路蛋白及肠道屏障损伤的影响
16、未见报道,本文对此进行探讨,为白及多糖在UC领域的推广应用提供实验基础。1 材料与方法 1.1材料1.1.1实验动物SD健康清洁级雄性大鼠62只,体质量200220 g,购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场,生产批号:SCXK(豫)2019-0002。本研究经信阳职业技术学院动物伦理委员会批准,批号:IACUC-01(20190007)。1.1.2试剂白及多糖标准品(20 mg/瓶,类白色干燥粉末,含量 98%)购自北京伊塔生物科技有限公司;柳氮磺胺吡啶购自上海彩佑实业有限公司;三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)试剂购自北京科展生物科技有限公司;苏
17、木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司;肿瘤坏死因子-(TNF-)、IL-1、髓过氧化物酶(MPO)、二胺氧化酶(DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白(i-FABP)等ELISA试剂盒均购自上海钰博生物科技有限公司;NF-B p65、p-NF-B、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1抗体均购自美国Abcam公司。1.2方法1.2.1UC模型建立及分组参照文献 8 方法构建 UC 模型:麻醉大鼠,配制 2.5 mg/ml TNBS 溶液(含50%乙醇),将直径2.00 mm、长约12 cm的聚乙烯管用石蜡油润滑后,由肛门缓缓插入大鼠体内约8 cm,聚乙烯管
18、缓缓注入TNBS溶液0.8 ml,提起大鼠尾部使大鼠头部朝下持续2 min,保持大鼠头低足高姿势至自然苏醒,归入笼中自由饮食。造模后 第2天随机选取2只大鼠,解剖结肠组织,行苏木精-伊红染色,显微镜下观察,结肠溃疡、充血、水肿表明造模成功。建模成功的大鼠分为UC模型组、白及多糖低、中、高剂量组、阳性组,每组 10只;另取 10只大鼠,除经聚乙烯管注入生理盐水0.8 ml外,其余操作方法同模型组,自然苏醒后作为空白组。各组均于造模后第2天称重,开始给药,白及多糖及 阳性 药 参 照 文 献8-9设 置 剂 量,灌 胃 给 予 低 (100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg
19、/kg)剂量白及多糖及0.67 g/kg柳氮磺胺吡啶,空白组与模型组灌胃给予生理盐水,连续给药2周,1次/d。1.2.2一般行为观察及疾病活动指数(DAI)评分观察大鼠形体、活动、大便性状,称重,计算,体质量下降指数(%)=(给药前体质量给药后体质量)/给药前体质量100%。参照文献 8 观察大鼠一般行为并进行 DAI评分,体质量下降指数评分:0分,体质量下降指数10%。大便情况评分:0分,大便正常;1 分,大便松软但成形;2 分:大便松软但不成形;3分:大便稀溏。1.2.3各组大鼠结肠组织HE染色各组大鼠DAI评分后,麻醉处死,解剖取结肠组织,磷酸缓冲盐清洗,剪取0.5 g结肠组织于80 保
20、存备用,其余结肠组织用4%多聚甲醛固定,制成石蜡切片(5 m),HE染色,显微镜下观察。1.2.4各组大鼠结肠组织炎症指标及肠屏障损伤指标检测取冰冻结肠组织4 解冻,加组织裂解液机械匀浆处理,取匀浆液,ELISA 检测炎症指标 MPO、IL-1、TNF-及 肠 屏 障 损 伤 指 标 DAO 和 i-FABP含量。1.2.5 Western blot 检 测 NF-B p65、p-NF-B、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达取结肠组织匀浆液,提取蛋白,BCA 法测定蛋白浓度,50 g1624邱波等 基于NF-B/NLRP3/caspase-1通路研究白及
21、多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症损伤的保护作用 第 8 期蛋白上样,电泳、转膜,加入 NF-B p65、p-NF-B、NLRP3、caspase1、cleaved caspase-1 抗体(1 1 000)及内参-actin(1 2 000)孵育过夜,羊抗兔二抗 (1 1000)室温孵育 2 h,ECL 显色,Bio-Rad 软件扫描,Image-J软件分析条带灰度值。1.3统计学分析采用SPSS22.0软件统计数据,以x s表示,组间差异采用单因素方差分析,两组间多重比较行 LSD-t 检验,P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 2.1白及多糖对大鼠一般行为及 DAI 评分的影响空白组大
22、鼠活动、体质量、大便正常。与空白组比较,模型组大鼠形体消瘦、活动减少,时有弓背舔腹行为,大便稀溏且肉眼可见血液夹杂,DAI评分升高(P0.05);与模型组比较,白及多糖各剂量组及阳性组大鼠形体消瘦、大便稀溏等现象均有不同程度改善,DAI 评分降低,且呈剂量依赖性(P0.05,表1)。2.2白及多糖对大鼠结肠组织病理损伤的影响空白组大鼠结肠组织黏膜上皮细胞排列整齐,形态完整;模型组大鼠结肠组织黏膜上皮细胞脱落坏死、黏膜及黏膜下层充血、扩张及炎症细胞浸润明显;与模型组比较,白及多糖低、中、高剂量组及阳性组大鼠结肠组织黏膜充血、扩张及炎症细胞浸润等病理现象均不同程度减轻(图1)。2.3白及多糖对大鼠
23、炎症指标MPO、IL-1、TNF-含量的影响与空白组比较,模型组大鼠结肠组织MPO、IL-1、TNF-含量均升高(P0.05);与模型组比较,白及多糖各剂量组及阳性组 MPO、IL-1、TNF-含量降低,且呈剂量依赖性(P0.05,表2)。2.4白及多糖对大鼠结肠组织肠屏障损伤指标DAO和i-FABP含量的影响与空白组比较,模型组大鼠结肠组织DAO、i-FABP含量均降低(P0.05);与模型组比较,白及多糖各剂量组及阳性组DAO、i-FABP含量升高,且呈剂量依赖性(P0.05,表3)。表1各组大鼠DAI评分比较(x s,n=10)Tab.1Comparison of DAI scores
24、of rats in each group(x s,n=10)GroupsBlankModelBSP low-doseBSP medium-doseBSP high-dosePositiveDAI scores 0.000.005.890.211)4.880.201)2)3.510.191)2)3)2.350.181)2)3)4)2.450.201)2)3)4)Note:Compared with blank group,1)P0.05;compared with model group,2)P0.05;compared with BSP low-dose group,3)P0.05;comp
25、ared with BSP medium-dose group,4)P0.05.表2各组大鼠结肠组织 MPO、IL-1、TNF-比较(x s,n=10)Tab.2Comparison of MPO,IL-1 and TNF-in colon tissues of rats in each group(x s,n=10)GroupsBlankModelBSP low-doseBSP medium-doseBSP high-dosePositiveMPO/(U mg1)0.090.132.620.121)1.900.131)2)1.620.161)2)3)1.010.141)2)3)4)1.030
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