肌萎缩侧索硬化症模型小鼠脑干蛋白质组学分析.pdf
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1、熊伯成,黎上明,但丁,等.肌萎缩侧索硬化症模型小鼠脑干蛋白质组学分析J.中南医学科学杂志,2023,51(5):630-634.收稿日期 2023-05-08修回日期 2023-08-12基金项目 国家自然科学基金项目(82171583);深圳市科技创新委员会重点基础研究计划项目(JCYJ20200109150717745XY、JCYJ20200109144418639);深圳香港脑科学研究所-深圳基础研究项目(NYKFKT20190019);深圳市医学重点学科建设经费资助(SZXK069);深圳市医疗卫生三名工程项目(SZSM201611090)作者简介 熊伯成,硕士研究生,研究方向为神经退
2、行性疾病的预防和治疗,E-mail 为 1198696493 。通信作者杨细飞,博士,研究员,博士研究生导师,研究方向为神经退行性疾病的风险因素、早期诊断及治疗,E-mail 为 xifeiyang 。基础医学DOI:10.15972/ki.43-1509/r.2023.05.002肌萎缩侧索硬化症模型小鼠脑干蛋白质组学分析熊伯成1,2,黎上明2,但丁2,邹良玉3,杨细飞1,21.山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030000;2.深圳市疾病预防控制中心 深圳市现代毒理学重点实验室深圳市卫生毒理学医学重点学科,广东深圳 518000;3.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院南方科技大学第一
3、附属医院神经内科,广东深圳 518020摘 要 目的 研究肌萎缩侧索硬化症(ALS)模型小鼠脑干蛋白谱表达情况及其发病机制。方法 采用 18 周龄携带人类 SOD1 基因突变体的 ALS 模型(SOD1G93A)雌鼠(模型组)和野生型雌鼠(对照组)为研究对象。采用抓力测试评估小鼠四肢肌肉力量;悬挂测试和转棒测试评估小鼠的抓取力、耐力、平衡能力;爬竿测试和步态测试评估小鼠运动能力和协调能力。麻醉后取脑干组织用 TMT 标记,蛋白质组学分析两组差异表达蛋白,并进行 GO 与KEGG 富集分析。结果 与对照组小鼠比较,ALS 小鼠四肢肌肉力量、抓取力、耐力和平衡能力、运动能力和协调能力下降。脑干蛋白
4、质组学共鉴定和量化了 6 702 种蛋白质,筛选出差异表达蛋白 423 个,其中上调蛋白 265 个,下调蛋白 158 个。DAVID 基因本体论分析结果显示,ALS 小鼠脑干中蛋白富集于胶原蛋白纤维组织、细胞黏附蛋白、线粒体、细胞死亡的负调控等,KEGG 通路主要富集于 EMC-受体相互作用、MAPK 信号通路等。结论 ALS 小鼠脑干中炎症相关蛋白上调,线粒体相关蛋白和凋亡相关蛋白下调,提示多种机制参与了 ALS 疾病的发生发展。关键词 肌萎缩侧索硬化症;脑干;蛋白质组学;炎症中图分类号 R741文献标识码 AProteomic analysis of brainstem in a mou
5、se model of amyotrophic lateral sclerosisXIONG Bocheng1,2,LI Shangming2,DAN Ding2,ZOU Liangyu3,YANG Xifei1,21.School of Public Health,Shanxi Medical University,Taiyuan 030000,Shanxi,China;2.Shenzhen Key Laboratory of ModernToxicology,Shenzhen Medical Key Discipline of Health Toxicology,Shenzhen Cent
6、er for Disease Control and Prevention,Shenzhen518000,Guangdong,China;3.Department of Neurology,1st Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology,2nd Clinical Medial College of Jinan University,Shenzhen Peoples Hospital,Shenzhen 518020,Guangdong,ChinaABSTRACT Aim To study the e
7、xpression profile of brainstem proteins in a mouse model of Amyotrophic LateralSclerosis(ALS)and elucidate its pathogenic mechanisms.MethodsFemale mice carrying the human SOD1 genemutation(SOD1G93A)and non-transgenic littermates(18 weeks of age)were used.Grip strength test was used to assessmuscle s
8、trength of the mices limbs;hanging wire test and rotarod test were used to evaluate their endurance and balance a-bility;pole test and gait analysis were used to evaluate their motor and coordination ability.After anesthesia,brain stemtissue was taken and labeled with TMT.Proteomics analysis was per
9、formed to analyze the differentially expressed proteinsbetween the two groups,and GO and KEGG enrichment analysis was performed.Results Compared with the controlgroup mice,ALS mice showed a decrease in limb muscle strength,grip power,endurance and balance ability,motor abili-ty,and coordination abil
10、ity(P0.05).6 702 proteins in brainstem were identified and quantified by proteomics,and423 differentially expressed proteins were screened,including 265 up-regulated proteins and 158 down-regulated proteins.DAVID gene ontology analysis showed that the proteins in the brainstem of ALS mice were enric
11、hed in collagen fiber organi-zation,cell adhesion proteins,mitochondria,and negative regulation of cell death,etc.The KEGG pathway was mainlyenriched in the EMC-receptor interactions and MAPK signaling pathway.ConclusionThe protein expression profilein the brainstem of the model mice underwent signi
12、ficant changes:inflammation-related proteins were upregulated,whilemitochondria-related proteins and apoptosis-related proteins were downregulated.This suggests that multiple mechanismsare involved in the occurrence and progression of ALS in the mouse model.KEY WORDS amyotrophic lateral sclerosis;br
13、ainstem;proteomics;inflammation036ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,2023肌 萎 缩 侧 索 硬 化 症(amyotrophic lateralsclerosis,ALS)是一种致命的进行性神经退行性疾病,以进行性运动神经元死亡为特征,表现为肌肉无力、进行性瘫痪,并在发病后 3 5 年内因呼吸衰竭而死亡1-2。ALS 的发病机制尚不完全清楚,主要的机制假说有 RNA 毒性、兴奋性毒性、蛋白质稳态破坏、神经炎症、轴突运输缺陷、氧化应激和线粒体功能障
14、碍3。在 ALS 的病理过程中,脑干是重要的受损部位,ALS 患者出现呼吸、循环和消化功能障碍,同时脑干调节运动和感觉功能也受到影响,导致患者出现肌无力、肌萎缩和肌阵挛等症状。研究表明,ALS患者的延髓和脑桥出现了病理学上的改变,如神经元丧失和胶质细胞激活4。磁共振成像显示,ALS患者的脑干体积较健康人群明显缩小5。脑干作为脑组织的一部分,对 ALS 的发生发展有至关重要的作用,但关于 ALS 与脑干关系的研究较少。本研究对 ALS 模型小鼠脑干蛋白质组学进行分析,为药物开发提供新的思路和视角。1 材料和方法1.1 主要材料13 周龄携带人类 SOD1 基因突变体的 ALS 模型(SOD1G9
15、3A)雌鼠体质量(22.200.97)g和野生型雌鼠体质量(19.600.71)g各 4 只,均购自常州卡文斯实验动物有限公司;TMT 标记试剂盒、蛋白酶和磷酸酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher 公司;胰蛋白酶购自 Promega 公司;脱盐柱购自 OASIS 公司;三乙基碳酸氢铵、乙腈、TFA、NaH2PO4、NaCl 购自 Sigma 公司;尿素、DTT、IAA 购自 GEhealthcare 公司;抓力测试仪购自安徽正华生物仪器设备有限公司;小鼠步态分析系统购自诺达思(北京)信息技术有限责任公司。1.2 动物分组将 13 周龄 SOD1G93A雌鼠作为模型组,
16、野生型雌鼠作为对照组。所有小鼠均在深圳市疾病预防控制中心饲养许可证号:SYXK(粤)2022-0282,伦理号:ER-0013-005。小鼠置于 12 h 明暗周期、(222)、55%15%湿度的房间中生活,自由饮水和进食。1.3 行为学测试小鼠 18 周龄末检测行为学(抓力、爬杆、转棒、悬挂、步态);随后戊巴比妥钠麻醉,取出脑干立即放入-80 冰箱中。1.3.1 抓力测试将小鼠轻放于仪器抓板的中央,等小鼠抓稳抓板后,均匀用力轻轻地拉小鼠尾巴。每只动物测试 3 次,取 3 次结果最大值。抓力值越大说明四肢肌肉力量越大。1.3.2 悬挂测试每只动物被放置在一个60 cm40 cm 的金属网中央。
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