花生致敏蛋白Ara h 3单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定.pdf
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1、2023年第36 卷第9 期花生致敏蛋白Ara h 3单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定孙富宇,席俊,范雨函,水天娇,杨欢欢,尚阿晨(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州450 0 0 1)摘要:以Ara h3为免疫原免疫小鼠。选取血清效价高的小鼠再次免疫,制备出脾细胞后与骨髓瘤细胞一起进行细胞融合,得到杂交瘤细胞株,筛选阳性株制备大量单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对制备的单克隆抗体进行效价测定、敏感性测定和特异性测定。通过蛋白质免疫印迹试验进一步验证其特异性。结果表明:免疫性较好的4B2单克隆抗体经纯化后的效价为1:5.1210。由敏感性测定得知4B2单克隆抗体的半抑制浓度(I
2、Cso)为38 9 ng/mL,证明其具有较好的敏感性,交叉反应率小于0.5%,成功制备出纯度高、效价高、敏感性好、特异性强的Arah3鼠源单克隆抗体,为建立免疫学快速检测方法奠定了基础。关键词:Arah3;单克隆抗体;酶联免疫吸附试验Preparation and immunological characterizationof monoclonal antibody against peanut sensitizing protein Ara h 3SUN Fu-yu,XI Jun,FAN Yu-han,SHUI Tian-jiao,YANG Huan-huan,Shang A-chen(
3、College of Food Science and Engineering,Henan University of Technology,Abstract:Mice were immunized with Ara h 3 as immunogen.Mice with high serum titer were selected tobe immunized again,spleen cells were prepared and then fused with myeloma cells to obtain hybridomacell lines,and a large number of
4、 monoclonal antibodies were prepared by screening positive strains.Thetiter,sensitivity and specificity of the monoclonal antibody were determined by enzyme-linked immunosor-bent assay(ELISA).The specificity was further verified by western blot assay.The results showed thatthe titer of purified 4B2
5、monoclonal antibody with good immunity was 1:5.12 105.According to thesensitivity assay,the median inhibitory concentration(ICso)of 4B2 monoclonal antibody was 389 ng/mL,which proved that it had good sensitivity and cross-reaction rate was less than 0.5%.Ara h3 murinemonoclonal antibody with high pu
6、rity,high titer,good sensitivity and strong specificity was successfullyprepared.It lays a foundation for the establishment of rapid detection method for immunology.Key words:Ara h 3;monoclonal antibody;ELISA中图分类号:TS201.6花生是重要的油料和粮食作物,因其富含蛋白质和矿物质,而被广泛应用于食品中 1-2 。联合国粮食及农业组织将花生列为八大致敏原之一 3,过敏人群食用花生后,轻者
7、会产生腹部痉李,重者会导致高血压和过敏性休克等 4。花生过敏具有普遍性和持续性,调查 5 发现,花生过敏的患病率一直在上升,且花收稿日期:2 0 2 3-0 5-2 6基金项目:国家自然科学基金面上项目(32 17 2 310)作者简介:孙富宇(19 9 6 一),男,硕士,研究方向为食品免疫学。通信作者:席俊(19 7 7 一),女,博士,教授,研究方向为食品免疫学。粮食与油脂Zhengzhou 450001,Henan,China)文献标志码:A79文章编号:10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)0 9-0 0 7 9-0 5生过敏的平均发病年龄为2 岁左右,大约7 5%的儿童在第1
8、次接触花生时出现反应,随着年龄的增长,花生致敏率会降低 6 。据统计,我国的花生过敏人群约占总过敏人群的2 1%7 。Ara h3是花生的主要过敏原之一,由1个酸性亚基和1个碱性亚基通过分子间二硫键保持共价链80接,并结合成非常稳定的六聚体结构 8 ,其酸性亚基的分子质量在40 45kDa,碱性亚基的分子质量约为2 5kDa。目前对花生致敏蛋白检测的方法主要有免疫层析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法、聚合酶链式反应法、免疫印迹法、生物传感器法和色谱法 9 ,其中免疫层析法具有特异、灵敏、简洁、快速、成本低廉等特点 10 。单克隆抗体技术广泛应用于许多相关行业中,其中在检测和医药行业的应用最
9、为突出,制备出优良的单克隆抗体是建立免疫学检测方法的关键。本研究将从脱脂花生粉中分离纯化Arah3,以此为抗原免疫小鼠,并制备鼠源单克隆抗体,为花生致敏蛋白的免疫学快速检测方法奠定基础。1材料与方法1.1材料与试剂SPF级6 8 周龄Balb/c 雌性小鼠,河南省实验动物中心;小鼠SP2/0骨髓瘤细胞,实验室保存培养;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、四季青胎牛血清、羊抗小鼠酶标二抗、TMB单组分显色液、吐温-20、体积分数50%聚乙二醇(PEG1500)溶液、RPMI1640基础培养基、次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)及次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT)选择培养基、化学发光底物试剂盒(ELC)
10、、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,北京索莱宝科技有限公司;液体石蜡,天津市致远化学试剂有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液(CBS)、葡萄糖氯化钠钾注射液(GNK)、完全培养基(9 mLRPMI1640基础培养基+1mL四季青胎牛血清)、饱和硫酸铵溶液、终止液2 moL/LH,SO4)、伴花生球蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、麦蛋白、乳清蛋白、花生致敏蛋白Arah3,实验室制备。1.2仪器与设备Multiskan酶标仪,美国Thermo公司;电泳仪、Tanon2500全自动数码凝胶图像分析系统,上海天能科技有限公司;SW-CJ-2F型双人双面精华工作台,苏州净化设备有限公司;UB203i正
11、置显微镜,重庆澳浦光电技术有限公司;H2050R大容量高速台式冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1.3试验方法1.3.1动物免疫参照GUO等 11 的方法,对4只SPF级6 8 周龄Balb/c雌性小鼠进行免疫试验,抗原(Arah3)剂量为6 0 g/只,首次免疫将抗原与等体积弗氏完全粮食与油脂佐剂乳化,然后以30 0 0 r/min充分乳化免疫原约10min。充分乳化的标准为取少量免疫原滴人水中不分散,乳化后对小鼠进行皮下多点注射。每隔3周加强1次免疫,用弗氏不完全佐剂乳化抗原,总计免疫5次(每次免疫剂量均为2 0 0 L)。最后1次免疫7 d后,断尾取血,离心后取上层血清,测定其
12、效价。选取效价最高的小鼠,在试验开始前3d采用腹腔注射方式再次免疫,免疫剂量2 0 0 L,用无菌 PBS 作为佐剂。1.3.2杂交瘤细胞的建立参照王耀 12 的方法,从小鼠体内分离出脾脏后进行研磨,用GNK溶液冲洗,以10 0 0 r/min离心10min后用GNK溶液重悬,弃去上清液,重复清洗后得到脾细胞。复苏SP2/0骨髓瘤细胞方法为在无菌条件下用PEG1500溶液将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行融合,缓慢滴加1mL的PEG1500溶液后,轻微晃动,然后缓慢加入15mLGNK溶液,以1000r/min离心10 min,弃去上清液,用HAT培养基重悬,置于9 6 孔细胞培养板。通过10
13、倍显微镜观察细胞团面积,若细胞团生长至目镜观察区域一半面积时,用间接ELISA法筛选出阳性孔。14d后改用HT培养基,再过14d后改用完全培养基。对选出的阳性孔按有限稀释法进行亚克隆,待克隆成型后,最终获得2 株稳定的杂交瘤细胞,将其转移到培养瓶中进行大量培养并冻存备用。1.3.3Arah3单克隆抗体的大量制备参照CHEN等 13 的方法,采用体内诱生腹水法进行Arah3鼠源单克隆抗体的大量制备。首先在小鼠腹腔内注射50 0 L石蜡,7 d后腹腔注射杂交瘤细胞(0.6 10 2 10 个),再过7 d后每天观察小鼠,当小鼠腹部肿胀时立即收集腹水,可重复收集直至腹水不再产生。将采集的腹水以30
14、0 0 r/min离心10 min,收集上清液,于-2 0 存放。1.3.4Arah3单克隆抗体的纯化参照李研等 14 的方法,将1mL单克隆抗体和1mLPBS溶液混合,然后加人2 mL饱和硫酸铵溶液,置于4下过夜后,以10 0 0 0 r/min离心20min,弃去上清液,用2 mLPBS溶液复溶,在4条件下静置过夜后,同上离心,弃去上清液,沉淀用1mLPBS溶液复溶,最后在4条件下用PBS溶液透析3d,每隔6 8 h更换1次透析液。1.3.5Arah3单克隆抗体的效价测定参照文献 15-16 采用间接ELISA法,用CBS将2023年第36 卷第9 期2023年第36 卷第9 期Arah3
15、稀释成5g/mL后,每孔加人10 0 L,在4条件下包被14h后,用PBST溶液(吐温2 0和PBS体积比1:19 9 9)洗板并拍干;每孔加人200L封闭液(脱脂奶粉和PBST质量比1:2 0),以37孵育2 h,洗板,拍干;加人稀释梯度(第1孔加入单克隆抗体与PBS体积比1:1.0 0 10 3最后1孔为1:5.12 10)的单克隆抗体,设置阴性孔(未免疫的鼠血清)和空白孔(PBS),以37 孵育1h,洗板,拍干;每孔加人50 L羊抗小鼠酶标二抗(羊抗小鼠酶标二抗和封闭液体积比1:50 0 0),以37 孵育1h,洗板,拍干;每孔加入50 L显色液,避光反应5min,最后每孔加人50 L的
16、终止液终止显色,并用酶标仪测定 OD450。O D 450(检测孔)/OD450(阴性孔)2.1 为阳性。1.3.6纯化后单克隆抗体的敏感性鉴定将效价测定中的加单克隆抗体改为加人梯度稀释的Ara h3溶液(质量浓度范围0 40 0 0 ng/mL)100L/孔,同时加人等体积稀释后的单克隆抗体(稀释倍数为OD450=1左右),其余步骤同效价测定。参照YU等 17 的方法,绘制敏感性曲线,根据敏感性曲线的回归方程确定单克隆抗体的半抑制浓度(ICso)。1.3.7纯化后单克隆抗体的特异性鉴定参照姚利利等 18 的方法,用间接竞争ELISA法测定单克隆抗体与伴花生球蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、麦蛋
17、白、乳清蛋白的交叉反应性。将敏感性测定方法中不同质量浓度的Arah3调整为以上其他不同质量浓度梯度的蛋白质。1.3.8纯化后单克隆抗体的蛋白质免疫印迹试验鉴定参照CHEN等 19 的方法,用PBS溶解Arah3,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后在110 mA电流、8 0 V电压条件下电转10 0 min至PVDF膜;之后将PVDF膜封闭1h,洗膜4次,每次5min;与单克隆抗体以4反应14h,洗膜;羊抗小鼠酶标二抗(羊抗小鼠酶标二抗与PBS体积比1:50 0 0)孵育1h,洗膜;最后用ECL显影,定影。2结果与分析2.1纯化前后单克隆抗体价测定由表1可知:经纯化后
18、2 E1单克隆抗体的效价略有上升,4B2单克隆抗体效价无变化。总体而言,4B2单克隆抗体纯化前后的效价均优于2 E1单克隆粮食与油脂抗体。因此,选取4B2单克隆抗体进行后续试验表1纯化前后单克隆抗体效价编号单克隆抗体效价2E11:1.28 1054B21:5.12 1052.2纯化后4B2单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定4B2单克隆抗体纯化后抗体质量浓度为4.248mg/mL,用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定抗体的纯度。由图1可知:纯化后的4B2单克隆抗体呈现2条清晰的条带,分别是IgG重链和IgG轻链,而剩余杂蛋白质的含量较少,证明已经获得了较高纯度的4B2单克隆抗体。kDa M1175805
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