鸡SLC基因超家族分析及其在蛋壳形成不同时期的表达特征.pdf
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1、7期2101鸡SLC基因超家族分析及其在蛋壳形成不同时期的表达特征高志群,虞霖田,陆阳清*(广西大学动物科学技术学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530004)摘要:【目的】鉴定出在蛋壳形成过程中可能参与钙转运的溶质载体(SLC)基因超家族成员,并分析SLC基因在蛋壳形成不同时期的表达特征,为进一步探究SLC基因与蛋壳形成的相关性及揭示钙转运调控机制打下基础。【方法】基于NCBI和Ensembl数据库,检索并整理鸡SLC基因超家族全基因信息,通过ProtParam、Pfam、TBtool、NPS:SOPMA、Euk-mPLoc 2.0及MEGA 11.0等在线软件进行生
2、物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR分析钙转运相关SLC基因在蛋壳形成不同时期的表达特征。【结果】鸡SLC基因超家族包括56个亚家族,分布在包括Z染色体在内的32条染色体上,其编码蛋白主要分布在内质网和细胞膜上,大多数为疏水的碱性蛋白,涵盖81种结构域,主要参与核苷酸、糖类、氨基酸、神经递质、无机离子及有机离子等物质的运输,其中与钙离子(Ca2+)相关的SLC亚家族基因有SLC4、SLC8、SLC9、SLC24和SLC30。SLC8和SLC24亚家族基因在进化分支上的亲缘关系很近,存在直接与Ca2+转运的结构域,主要定位在细胞膜和内质网上。实时荧光定量PCR检测结果表明,控制Ca2+的SLC
3、8和SLC24基因在产蛋鸡子宫部的表达显著高于未产蛋鸡(P0.05,下同),进一步说明二者确实参与调控Ca2+跨膜运输,但各成员间分工有所不同。【结论】鸡SLC基因超家族编码产物多为疏水的碱性蛋白,含有结合多种物质的结构域,定位于细胞或多种亚细胞结构膜上,表明SLC家族蛋白成员参与多种物质的跨膜转运过程。其中,SLC8和SLC24亚家族基因在蛋壳形成过程中协同调控Ca2+从内质网释放并完成跨膜运输,分泌到输卵管子宫部而参与蛋壳的形成。关键词:鸡;SLC基因超家族;蛋壳形成;钙转运;表达特征中图分类号:S831.2文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)07-2101-14收稿日期
4、:2022-09-19基金项目:国家自然科学基金项目(31960157);国家重点研发计划项目(2021YFD1300100);广西重点研发计划项目(桂科AB21220005)通讯作者:陆阳清(1976-),https:/orcid.org/0000-0003-1641-6142,博士,研究员,博士生导师,主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作,E-mail:第一作者:高志群(1997-),https:/orcid.org/0009-0007-3878-2019,研究方向为动物繁殖与育种,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(7):
5、2101-2114ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.022Analysis of chicken SLC gene superfamily and its expressioncharacteristics in different stages of eggshell formationGAO Zhi-qun,YU Lin-tian,LU Yang-qing*(Animal Science and Technology College,Guangxi University/State K
6、ey Laboratory of SubtropicalAgriculturalBiological Resources Conservation and Utilization,Nanning,Guangxi 530004,China)Abstract:【Objective】Identified members of the solute carrier(SLC)gene superfamily that might be involved in cal-cium transport during eggshell formation,and analyzed the expression
7、characteristics of SLC genes at different stages ofeggshell formation to lay the foundation for further investigating the correlation between SLC genes and eggshell forma-tion and reveal the regulatory mechanism of calcium transport.【Method】Based on the NCBI and Ensembl databases,theentire gene info
8、rmation of the chicken SLC gene superfamily was retrieved and organized,and bioinformatics analysiswas performed through online software such as ProtParam,Pfam,TBtool,NPS:SOPMA,Euk-mPLoc 2.0 and MEGA11.0;moreover,real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression characterist
9、ics of calciumtransport-related SLC genes at different stages of eggshell formation.【Result】The SLC gene superfamily in chickens in-cluded 56 subfamilies,which were distributed on 32 chromosomes including the Z chromosome.The encoded proteinswere mainly distributed in the endoplasmic reticulum and c
10、ell membrane,and most of them were hydrophobic and alka-line proteins.They encompassed 81 structural domains and were mainly involved in the transportation of substances suchas nucleotides,sugars,amino acids,neurotransmitters,inorganic ions,and organic ions.Among them,the SLC gene54卷南 方 农 业 学 报 2102
11、0引言【研究意义】溶质载体基因(Solute carrier gene,SLC)超家族广泛分布于机体的各种细胞中,其编码蛋白均为转运蛋白,可分为4种类型:孤儿转运蛋白、易化转运蛋白、交换转运蛋白和协同转运蛋白,而转运的物质包括无机离子、有机离子、氨基酸、神经递质及糖类等(Li et al.,2008;Jonchre et al.,2012)。在哺乳动物上,SLC基因超家族的相关研究较深入(He et al.,2009),但在禽类上有关SLC基因超家族的生物信息学分析尚无文献报道。因此,针对家禽SLC基因超家族进行系统分析,并探究SLC基因在蛋壳形成过程中不同时期的表达特征,对开展禽类SLC家族
12、成员研究及揭示钙转运调控机制具有重要意义。【前人研究进展】蛋壳是禽类动物在进化过程中为保证自身繁衍而形成的一种高度精密且有序的矿化结构,可为胚胎的发育提供充足空间,并抵抗来自外界的侵害,如机械压力及微生物侵入等(吴磊等,2020;廖朝美等,2021)。在种用蛋鸡中,蛋壳具有重要的功能作用:(1)保证胚胎发育所需的水分;(2)多孔结构为胚胎发育过程中的气体交换创造了条件;(3)在卵黄中钙耗尽时为胚胎发育提供钙补充等(Nys et al.,2004;Rose and Hincke,2009),因此蛋壳品质已成为种蛋选留的关键指标。此外,蛋壳品质与商品蛋种的破损率、存储时间及市场消费偏好密切相关。禽
13、类输卵管是禽蛋产生的重要场所,大致可划分为5个部分(杨文豪等,2020):漏斗部(伞部)、膨大部、峡部、子宫部及阴道部。鸡排卵后经45 h到达子宫部,在此处经过1820 h形成蛋壳(Wassermanet al.,1991),而蛋壳的形成大致又可分成3个阶段(Hincke et al.,2008):蛋壳形成初始阶段、快速沉积期和矿化末期。蛋壳主要由碳酸钙和有机基质蛋白组成,其中碳酸钙占全蛋壳质量的95%98%(Marieet al.,2014)。蛋壳质量与钙含量有关,在饲料中添加碳酸钙能有效提升蛋壳品质(Rodrigues et al.,2013)。还有研究表明,维生素D3、钙转运蛋白及雌激素
14、等可调节钙的吸收,进而影响蛋壳质量(Mattilaet al.,2004;孙杰等,2010;Wistedt et al.,2014;张亚男等,2021)。在蛋壳形成过程中,大量钙离子(Ca2+)和碳酸氢根离子(HCO3-)经输卵管子宫部上皮细胞,由血液转运到子宫液中。可见,子宫部Ca2+的转运对蛋壳形成的影响至关重要。蛋壳的形成过程涉及许多有机物和无机离子的跨膜运输,据研究推测子宫液中包含的大量Ca2+主要通过跨细胞途径、囊泡转运和细胞旁通路3种方式,从子宫上皮细胞转运到子宫腔中(Jonchre et al.,2010,2012;Sta-pane et al.,2020;Gautron et
15、al.,2021)。目前,有关蛋壳质量的研究主要是探究子宫液基质蛋白对碳酸钙方解石形态和排列的调控,包括骨桥蛋白(OPN)(Lavelin et al.,1998;Hincke et al.,2000)、Ovoclei-din-17(OC-17)(Reyes-Grajeda et al.,2004)及Ovo-cleidin-116(OC-116)(Dunn et al.,2009;杨凌霄和刘长国,2015;张迎燕等,2022)等。Brionne等(2014)、Sah等(2018)、Yang等(2020)先后从输卵管子宫部筛选出参与蛋壳形成过程的差异表达基因(Differen-tially ex
16、pressed genes,DEGs),其中就包括SLC基因超家族。目前,NCBI已公布有关鸡的SLC基因超家族共包括343个基因,其中229个基因已被鉴定与分子运输有关(Lim et al.,2012)。【本研究切入点】SLC基因超家族成员在机体内参与胞内外物质转运,包括氨基酸、糖类、脂类及无机盐离子等,广泛存在于机体的各种细胞中(Rebsamen et al.,2022)。鸟类蛋壳的形成过程受多种因素调控,且该过程有大量离子分泌到输卵管子宫部并沉积在蛋壳上,尤其是Ca2+的转运与沉积,但SLC基因超家族成员是否参与subfamilies related to calcium ions(Ca
17、2+)included SLC4,SLC8,SLC9,SLC24 and SLC30.The SLC8 and SLC24 sub-family genes had a close evolutionary relationship and possessed structural domains directly related to Ca2+transport.Theywere mainly located on the cell membrane and endoplasmic reticulum.Real-time fluorescence quantitative PCR detec
18、tionresults showed that the expression of SLC8 and SLC24 genes,which regulated Ca2+,in the uterus of laying hens was sig-nificantly higher than that in non-laying hens(P0.05,the same below),further indicating that both were indeed in-volved in the regulation of Ca2+transmembrane transport,but with d
19、ifferent functions among members.【Conclusion】Thecoding products of the chicken SLC gene superfamily are mostly hydrophobic alkaline proteins,which contain structuraldomains that bind to various substances.They are localized on the cell or various subcellular membrane structures,indi-cating that SLC
20、family protein members are involved in the transmembrane transport of various substances.Among them,SLC8 and SLC24 subfamily genes cooperatively regulate the release of Ca2+from the endoplasmic reticulum during the for-mation of eggshells and complete the transmembrane transport,secretion to the ute
21、rine part of the oviduct,and participatein the formation of the eggshell.Key words:chicken;SLC gene superfamily;eggshell formation;calcium transport;expression characteristicsFoundation items:National Natural Science Foundation of China(31960157);National Key Research and Deve-lopment Program of Chi
22、na(2021YFD1300100);Guangxi Key Research and Development Project(GuikeAB21220005)7期2103鸟类蛋壳的形成过程目前尚未明确,参与Ca2+转运的SLC亚家族成员也未被鉴定。【拟解决的关键问题】以广西麻鸡为研究对象,收集鸡SLC基因超家族全基因信息并对其结构域、亚细胞定位、染色体位置信息及蛋白二级结构等进行预测分析,鉴定出在蛋壳形成过程中可能参与钙转运的SLC基因超家族成员,并通过实时荧光定量PCR分析SLC基因在蛋壳形成不同时期的表达特征,为进一步探究SLC基因与蛋壳形成的相关性及揭示钙转运调控机制打下基础。1材料与
23、方法1.1试验样品从广西富凤农牧集团有限公司广西麻鸡育种基地随机选取6只未开产(110日龄)和18只产蛋高峰期(180日龄)的麻鸡,采集其输卵管漏斗部、膨大部、峡部及子宫部组织样品,其中产蛋鸡输卵管各部位组织样品采集按照蛋壳形成的3个阶段(初始阶段、快速沉积期和矿化末期),即分别在产蛋后第6、11和21 h进行采样(表1)。蛋鸡屠宰后,迅速采集输卵管目标部位组织样品,经PBS清洗后放入标记的样本管并立刻液氮速冻,随后转移至-80 冰箱保存备用。1.2组织RNA提取及cDNA合成使用Total RNA Kit I试剂盒提取麻鸡输卵管各部位组织RNA,检测其浓度、纯度及完整性后,利用TransSc
24、riptUni All-in-One First-Strand cDNA Syn-thesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)试剂盒逆转录合成cDNA,-80 冰箱保存备用。1.3SLC基因超家族生物信息学分析登录NCBI下载鸡(Gallus gallus)SLC基因超家族全基因RNA及蛋白序列,通过对比Ensembl与Uni-prot数据库中收录的SLC基因超家族相关序列,确定最终用于分析的基因序列。基于GEO数据库对收集的转录组数据(GSE114103和GSE127974)进行基因差异表达分析,利用ExPASy中的ProtParam软件预测
25、SLC基因超家族编码相关蛋白理化性质,通过MEGA 11.0和TBtool构建SLC基因超家族的系统发育进化树及染色体位置信息,采用Pfam预测SLC基因超家族蛋白结构域,运用NPS:SOPMA和Eukm-PLoc 2.0预测SLC基因超家族蛋白二级结构及其亚细胞定位(Chou and Shen,2007,2010),并通过Gene-Cards-Human Genes|Gene Database|Gene Search分析基因功能。1.4引物设计与合成根据NCBI已公布的鸡SLC相关基因序列,通过Oligo 7及BLAST设计实时荧光定量PCR扩增引物(表2),委托北京擎科生物科技股份有限公司
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