DB37∕T 4053-2020 新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法.doc
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1、ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T 40532020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virus2020 - 07 - 09发布2020 - 08 - 09实施山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人:孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨
2、金兴、艾武、王友令、亓丽红。新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法1 范围本标准规定了新城疫病毒基因VII型(NDV)荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中,除采用特异的引物外,还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。当
3、它与DNA双链结合时,发出荧光,从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行,每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。4 试剂或材料除非另有说明,在分析中仅使用分析纯的试剂,水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 10磷酸盐缓冲液PBS:pH值7.2。4.2 研钵。4.3 病毒RNA提取试剂盒。4.4 SYBR Green I RT-PCR缓冲液。4.5 酶混合物:内含MLV反转录酶和RNase Inhibitor。4.6 DNA聚合酶。4.7 阳性对照:浓度为1.0105拷贝/L的阳性质粒。4.8 阴
4、性对照:水。4.9 DEPC水。5 仪器设备5.1 微量可调移液器:最大量程为10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 台式高速冷冻离心机:最高转速16 000 r/min。5.3 荧光定量PCR仪:温度范围4.0 99.9 。5.4 分析天平:精度为0.01 g。5.5 冰箱:规格为4 和-20 。5.6 二级生物安全柜。6 引物Forward Primer:5- CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3Reverse Primer:5-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3注: Y=C或T;R=A或G;K=G或T7 样品7.1 采集工具棉拭子,剪刀,镊子,
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