谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征.pdf
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1、110 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体 酶学性质表征江泽沅,柳羽哲,高 欣,曾 琦,闵伟红*(吉林农业大学食品科学与工程学院,小麦和玉米深加工国家工程实验室,吉林 长春 130118)摘 要:通过定点突变技术,提高高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)的催化活性,减少通路中代谢产物对其产生的反馈抑制和阻遏作用。对HSD与底物高丝氨酸分子进行对接,通过其空间结构分析,选择Asp61和Gly25两个关键位点进行定点饱和突变,通过酶活力筛选,发现突变体A61L和G25G较野生型(wild type,WT)
2、酶活力显著提高。对这两个突变体进行酶动力学和酶学性质研究,结果显示:相较于WT,A61L和G25G的Km值降低,底物亲和力增强,酶活力分别提高到1.21、1.35 倍;n值减小,正协同性增加;A61L和G25G最适温度与WT相同均为40;A61L最适pH值与WT相同为8.0,G25G最适pH值为8.5较WT提高;A61L和G25G酶活力半衰期较WT分别延长1 h和减少0.5 h;低浓度K、Mg2、Ca2对突变体和WT有激活作用;不同体积分数甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对突变体和WT有明显抑制作用;在125 mmol/L抑制剂浓度下,突变体受抑制作用较WT明显减弱。本研究获得酶活力提高、别构抑制
3、减弱的突变体G25G和A61L,为优化HSD合成代谢途径和构建高产蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸菌株提供了参考。关键词:谷氨酸棒状杆菌;高丝氨酸脱氢酶;酶学性质;定点突变;酶动力学Characterization of Enzymatic Properties of Single Mutants of Homoserine Dehydrogenase from Corynebacterium glutamicumJIANG Zeyuan,LIU Yuzhe,GAO Xin,ZENG Qi,MIN Weihong*(National Engineering Laboratory for Wheat a
4、nd Corn Further Processing,College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)Abstract:Site-directed mutagenesis was used to improve the catalytic activity of homoserine dehydrogenase(HSD)to reduce its feedback inhibition and repression by metabolites in the
5、 pathway.HSD was docked with the substrate homoserine,and its spatial structure was analyzed.Two key sites,Gly25 and Asp61,were selected for site-directed saturation mutation.The activity screening showed that the mutants A61L and G25G had significantly increased enzyme activity when compared to the
6、 wild type(WT).The kinetics and enzymatic properties of these two mutants were studied.It was found that compared to the WT enzyme,the Km values of G25G and A61L decreased,the substrate affinity increased,and the enzyme activity increased by 1.21 and 1.35 times,respectively;the n value decreased,and
7、 the positive synergy increased.The optimum temperature for A61L and G25G was 40,the same as that for WT;the optimum pH for A61L and WT was 8.0,which was lower than that(8.5)for G25G.The half-lives of A61L and G25G were 1 h longer and 0.5 h shorter than that of WT,respectively.Low concentrations of
8、K+,Mg2+,and Ca2+could activate the mutants and WT,while different concentrations of methanol,ethanol,acetonitrile and dimethyl sulfoxide had significantly inhibitory effects on the mutants and WT.At inhibitor concentrations of 125 mmol/L,the inhibitory effect was significantly weaker on the mutants
9、than on WT.The mutants G25G and A61L showed improved enzyme activity and weakened allosteric inhibition.This study provides a 收稿日期:2022-08-30基金项目:“十四五”国家重点研发计划重点专项(2021YFD2101000;2021YFD2101002);国家自然科学基金面上项目(31771967)第一作者简介:江泽沅(1997)(ORCID:0000-0002-5576-5938),男,硕士研究生,研究方向为发酵微生物选育与代谢调控。E-mail:*通信作者简
10、介:闵伟红(1971)(ORCID:0000-0002-6093-2104),女,教授,博士,研究方向为发酵工程、粮油科学与深加工技术。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 111reference for optimizing the biosynthetic pathway of HSD and constructing strains capable of producing high yield of methionine,threonine and isoleucine.Keywords:Corynebacterium glutamicum;homos
11、erine dehydrogenase;enzymatic propertiesDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220830-353中图分类号:Q517 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0110-07引文格式:江泽沅,柳羽哲,高欣,等.谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸脱氢酶单突变体酶学性质表征J.食品科学,2023,44(18):110-116.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220830-353.http:/JIANG Zeyuan,LIU Yuzhe,GAO Xin,et al.Characterization of en
12、zymatic properties of single mutants of homoserine dehydrogenase from Corynebacterium glutamicumJ.Food Science,2023,44(18):110-116.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220830-353.http:/蛋氨酸(Met)具有多种生理功能,在医药、饲料、食品等领域得到广泛应用1。在医药方面,Met具有保护肝脏、心肌、解毒、抗抑郁和降血压等生理活性,在临床治疗上应用广泛2;在饲料方面,
13、Met是禽畜类必需氨基酸之一,具有提供营养、提高动物免疫力和抗氧化力等功能3;在食品方面,Met被用作食品调味剂和营养强化剂。目前,工业上主要通过化学法和蛋白水解法获得Met,微生物合成法由于过量积累的Met对微生物生长有害,未被大规模应用于工业化生产4。天冬氨酸族氨基酸代谢途径是特异性生产Met的氨基酸代谢途径,天冬氨酸是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中合成Met的前体物质,在天冬氨酸激酶催化下生成天冬氨酰-4-磷酸,经过天冬氨酸半醛脱氢酶催化合成天冬氨酸半醛5。高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)参与天冬氨酸族氨
14、基酸代谢途径的第3步反应,通过NADPH将L-天冬氨酸-半醛还原为L-高丝氨酸(L-homoserine,L-HSE),调控碳流向高丝氨酸生成的方向进行,最终控制Met的合成6。因此,减弱或解除天冬氨酸族氨基酸代谢途径中HSD的抑制作用能够达到通过微生物合成法高产Met的目的。HSD是一种氧化还原酶,在谷氨酸棒状杆菌中由hom基因编码,催化中心在生物中具有不同折叠方式,其晶体结构主要分为二聚体结构和四聚体结构。在嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)7、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)8、极端嗜热古菌(Hyperthermophilic archae
15、al)9、超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)10和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)11中HSD为二聚体结构;在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)12、多核杆菌(Polynucleobacter)13和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)14中HSD为四聚体结构。Ogata等15通过结构分析,在超嗜热古菌中发现半胱氨酸(Cys)位于高丝氨酸结合位点内,并且Cys和烟酰胺环之间形成了共价键,进而抑制HSD活力。Kubota等16通过Sulfurisphaera tokodaii重组HSD被热处理后显著激活,得出热诱导
16、活化是由于HSD催化区域的特定构象发生变化。此外,Li Ning等17在谷氨酸棒状杆菌中,通过强启动子增强L-HSD和L-高丝氨酸乙酰转移酶表达,进一步通过发酵使O-乙酰-L-高丝氨酸提高产量。然而,对HSD基因突变生产Met的研究较少。申术霞等18成功获得酶活力显著提高的双突变体L200F/D215K,为构建高产Met工程菌提供了参考依据。因此,本研究在实验室成功构建pET-28a-HSD基础上,对HSD进行基因突变,以获得高活力HSD,并进一步对高酶活力菌株进行酶学性质表征。旨在通过对HSD分子空间结构改造,为以后研究HSD催化机制和构建高产Met工程菌株提供一定的理论依据。1 材料与方法
17、1.1 材料与试剂谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌DH5均由本实验室保存;pET-28a-HSD质粒由实验室构建。Taq聚合酶、定点突变试剂盒、核酸电泳Marker 日本TaKaRa公司;非预染蛋白电泳Marker、基因组DNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;高保真DNA聚合酶2Phanta Max Master Mix Vazyme(中国)公司;异丙基硫代-D-半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、卡那霉素 长春市翊博生物科技公司;LB(Luria-Be
18、rtani)培养基参照文献19配制,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)试剂参照文献20配制。1.2 仪器与设备TGL-20000CR低温离心机 上海安亭科学仪器厂;112 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程空气浴振荡器 东联电子技术开发有限公司;铝质梯度聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 德国Eppendorf AG公司;隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;可见分光光度计 沙鹰科学仪器(上
19、海)有限公司;蛋白印记转膜仪 美国Bio-Rad 公司;SE260蛋白电泳仪 美国GE公司;UVP GelStudio Plus凝胶成像仪 德国耶拿公司。1.3 方法1.3.1 HSD突变体构建以6dzs晶体结构为模板,利用同源建模方法获得了HSD的三维结构,使用软件Autodock4对催化底物L-HSE和NADP进行分子对接,得到HSD与催化底物的复合结构。采用Discovery Studio软件21确定了突变的氨基酸位点,利用Primer 5.0软件设计突变位点引物,以pET-28a-HSD质粒为模板进行饱和定点突变。反应条件:94 预变性5 min,94 变性90 s,56 退火1 mi
20、n,72 延伸10 min(扩增20 个循环);72 延伸15 min。突变PCR完成后,使用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳验证,保证质粒突变成功。随后,将质粒用Dpn I酶在37 金属浴中消化2 h,消化体系为缓冲液18 L、突变PCR产物2 L、Dpn I酶0.3 L22。将大肠杆菌DH5感受态细胞在冰上冰浴30 min,加入10 L消化后PCR突变产物,充分混匀后冰浴15 min,在42 金属浴热击90 s后再次冰浴10 min,加入900 L LB液体培养基,放入37、190 r/min摇床中培养12 h。将复苏的菌液5 000 r/min离心5 min,弃掉上清液,将剩余100
21、L菌液吹打混匀后,均匀地涂布于含卡那霉素的LB固体培养基中,在37 培养箱中过夜 培养23。挑取平板上单菌落进行扩大培养,经过菌液PCR验证后,将成功转化的菌液提取质粒进行测序。1.3.2 突变体的表达和纯化将大肠杆菌DH5成功突变pET-28a-HSD质粒转化到表达菌株BL21中,挑取单菌落进行扩大培养,对菌液进行PCR验证,确保质粒成功转化至大肠杆菌BL21中。按2%接种量接种到100 mL含卡那霉素的LB发酵培养基中,放在37 摇床中培养2 h,当菌液OD600 nm值在0.60.8之间时加入100 L诱导剂IPTG使其终浓度为1 mmol/L,放入摇床进行26、180 r/min诱导1
22、416 h。诱导后的菌液4、8 000 r/min离心10 min,弃掉上清液,用预冷磷酸盐缓冲溶液重悬菌体进行超声波破碎,4、8 000 r/min离心10 min,收集的上清液即为粗酶液。最后,将粗酶液进行镍柱纯化处理得到纯化液24。1.3.3 HSD活力测定将HSD的1 个酶活力单位定义为每10 min生成1 mol NADPH所需要的酶量,其酶活力根据NADPH在340 nm波长处吸光度的变化进行测定。反应体系总体积为5 mL:100 mmol/L Tris-HCl(7.5)、10 mmol/L MgCl2、80 mmol/L KCl、1.2 mmol/L NADP、20 mmol/L
23、 L-HSE、100 L酶液25-26。将反应体系置于37 水浴10 min后检测NADPH在340 nm波长处吸光度变化量。通过考马斯亮蓝法测定酶液中蛋白含量,每组实验做3 个平行27。1.3.4 HSD最适pH值和最适反应温度测定以L-HSE为底物,分别在不同pH值(6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5)和不同温度(25、30、35、40、45、50)条件下进行最适反应pH值和最适反应温度测定。将最高酶活力定义为100%,每组实验做3 个平行。1.3.5 HSD热稳定性测定将野生型(wild type,WT)和突变体分别置于最适温度下水浴保温,每隔1 h测定HSD活力,一共检测9
24、 h,进而计算得出HSD活力半衰期。将0 h的酶活力定义为100%,每组实验做3 个平行。1.3.6 金属离子、有机溶剂和底物抑制剂对HSD活力影响的测定以L-HSE为底物,测定不同浓度(20、60、100、200 mmol/L)下K、Mg2和Ca2对HSD活力影响;测定不同体积分数(1%、5%、10%、20%)甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜对HSD活力影响;测定不同浓度(1、5、10、20 mmol/L)的苏氨酸(Thr)、Met、ThrMet对HSD活力影响。将不添加金属离子、有机溶剂以及酶抑制剂的酶活力定义为100%,每组实验做3 个平行。1.3.7 酶动力学分析在酶活力反应体系中,以不同
25、浓度(1、5、10、20、30、40、50、70、90、100、200 mmol/L)L-HSE为底物,测定HSD活力,每组实验做3 个平行。根据Hill方程25V=VmaxSn/(KSn)在GraphPad Prism软件中进行非线性拟合。1.4 数据处理与分析每组实验重复3 次,结果表示为 s,数据使用软件SPSS 26.0进行分析,图表使用软件GraphPad Prism 8进行绘制。2 结果与分析2.1 HSD突变位点选择采用同源建模获得HSD三维结构,通过AutoDock对底物进行分子对接26,成功构建HSD复合结构(图1)。通过Discovery Studio软件确定底物周围4 范
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