冠突散囊菌与茶多酚复合物对免疫抑制小鼠的保护作用.pdf
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1、基金项目:湖南省教育厅科学研究项目(编号:C )作者简介:彭颖(),女,长沙商贸旅游职业技术学院讲师,硕士.E m a i l:q q c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()冠突散囊菌与茶多酚复合物对免疫抑制小鼠的保护作用P r o t e c t i v ee f f e c t o fE u r o t i u mc r i s t a t u mf e r m e n t a t i o nb r o t hm i x e dw i t h t e ap o l y p h e n o l so n i mm u n o s u p p r e s
2、 s i v em i c e彭颖P ENGY i n g(长沙商贸旅游职业技术学院,湖南 长沙 )(C h a n g s h aC o mm e r c ea n dT o u r i s mC o l l e g e,C h a n g s h a,H u n a n ,C h i n a)摘要:目的:探究冠突散囊菌发酵液与茶多酚复合物对环磷酰胺诱导的免疫功能低下小鼠的影响.方法:用剂量为 m g/k g的环磷酰胺连续d腹腔注射小鼠以建立免疫抑制模型.用高、中、低剂量的冠突散囊菌发酵液与茶多酚复合,连续灌胃免疫抑制小鼠 d,检测小鼠血液指标、脾脏指数、巨噬细胞吞噬系数、半数溶血值、迟发型
3、变态反应、血清中白介素(I L )及肿瘤坏死因子(T N F)质量浓度.结果:冠突散囊菌发酵液与茶多酚复合物能明显提高免疫抑制小鼠白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白含量、血清中溶血素水平、I L 水平,并增强其脏器指数、吞噬细胞的吞噬指数,改善小鼠迟发型变态反应.结论:冠突散囊菌发酵液与茶多酚复合物对小鼠具有免疫增强的功能.关键词:冠突散囊菌;发酵液;茶多酚;环磷酰胺;免疫抑制;免疫调节A b s t r a c t:O b j e c t i v e:T h i ss t u d ya i m e dt o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to fE
4、u r o t i u m C r i s t a t u mf e r m e n t a t i o n b r o t hm i x e d w i t h t e ap o l y p h e n o l s o n t h e i mm u n e i n d e x e s o f c y c l o p h o s p h a m i d ei mm u n o s u p p r e s s i v e m i c e M e t h o d s:I mm u n o s u p p r e s s i v e m o d e lw a se s t a b l i s h e
5、 db yi n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o no fc y c l o p h o s p h a m i d ew i t h m g/k gf o r d a y s H i g h,m i d d l ea n dl o w d o s eEC r i s t a t u mf e r m e n t a t i o nb r o t h m i x e d w i t ht e ap o l y p h e n o l sw a sa d m i n i s t r a t e dt oi mm u n o s u p p r
6、e s s i v em i c ei n t r a g a s t r i c a l l yf o r d a y s T h eb l o o di n d e x,s p l e e ni n d e x,m a c r o p h a g ep h a g o c y t i ci n d e x,h a l fh e m o l y s i sv a l u e,d e l a y e d t y p eh y p e r s e n s i t i v i t y,t h ec o n t e n to fI L a n dt u m o rn e c r o s i sf a
7、 c t o r(T N F)w e r em e a s u r e d R e s u l t s:EC r i s t a t u mf e r m e n t a t i o nb r o t hm i x e dw i t ht e ap o l y p h e n o l ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dt h en u m b e ro fw h i t eb l o o dc e l l s,r e db l o o dc e l l s,h e m o g l o b i n,s e r u mh e m o l y s
8、 i na n d I L o ni mm u n o s u p p r e s s i v e m i c e,e n h a n c e d t h e s p l e e n i n d e x a n dm o n o c y t e p h a g o c y t i ci n d e x,a n d i m p r o v e d t h e d e l a y e d t y p eh y p e r s e n s i t i v i t yo nm i c e C o n c l u s i o n:EC r i s t a t u mf e r m e n t a t i
9、 o nb r o t hm i x e dw i t h t e ap o l y p h e n o l s c a ne n h a n c e i mm u n i t yo nm i c e K e y w o r d s:E u r o t i u mC r i s t a t u m;f e r m e n t a t i o n b r o t h;t e ap o l y p h e n o l s;c y c l o p h o s p h a m i d e;i mm u n o s u p p r e s s i o n;i mm u n o m o d u l a t
10、 i o n营养不良、药物或化学物质暴露可导致免疫系统异常和免疫抑制,从而影响免疫系统功能,导致身体防御机制下降,并增加过敏性免疫反应、自身免疫性疾病,甚至肿瘤的发生.临床试验表明,免疫抑制可能与抗体、T淋巴细胞反应、巨噬细胞的吞噬作用和NK细胞活性直接相关.常见的免疫调节剂如盐酸左旋咪唑在治疗免疫功能低下患者过程中,易诱发其他的副作用.近年来,通过饮食调节来提高自身免疫力的相关研究越来越受关注.尤其是茶饮料的盛行,人们开始关注饮茶以改善身体健康.其中茯砖茶因含有独特的“金花菌”,被广泛关注.金花菌又名冠突散囊菌(E u r o t i u mC r i s t a t u m),是茯砖茶中主
11、要的益生菌,在形成过程中通过对茶多酚的生物转化,生成多种生物活性物质,使得茯砖茶具有调节机体免疫、抗氧化、抗菌抗病毒等功效.吴香兰等报道了茯砖茶水提取物可通过调节小鼠血清中白介素(I L )来影响小肠黏膜s l g A的分泌,调节肠道菌群平衡以改善小鼠肠道局部的免疫功能;且在一定剂量的茯砖茶水提物下,能提高巨噬细胞的吞噬功能,增强小鼠的非特异性免疫.茯砖茶提取液可增强免疫力可能与冠突散囊菌、茶多酚有关.茶多酚具有抗氧化、抗炎作用,可抑制F OO D&MA CH I N E R Y第 卷第期 总第 期|年月|小鼠肿瘤坏死因子(T N F)的表达,调节I L 、I L 等炎症因子的表达与释放,进而
12、促进小鼠受伤后的免疫应答.课题组前期研究表明,冠突散囊菌发酵液可通过刺激小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子I L 来增强小鼠免疫功能.近年来,关于茶多糖、茶多酚等生物活性物质的降脂减肥功效研究较多,但关于金花菌发酵液添加茶多酚在减轻免疫器官损伤和预防被抑制的免疫反应方面的研究尚未见报道.研究拟采用环磷酰胺诱导建立小鼠免疫功能低下模型,用不同浓 度冠 突 散囊 菌发 酵液 与 茶多 酚 配 伍 干 预 d,检测小鼠的血细胞、脾脏指数、I L 、迟发型变态反应等多个免疫学评价指标,初步探讨此干预方法在小鼠体内发挥的免疫调节作用,旨在为开发保健茶饮提供理论依据.材料与方法材料与试剂茶多酚:含儿茶素,E G
13、C G,长沙飞拓植物制品有限公司;冠突散囊菌:从湖南省益阳市茶厂茯砖茶中分离,保存于湖南农业大学食品科学技术学院;环磷酰胺:上海凯洋生物技术有限公司;绵羊红细胞、豚鼠血清:长沙维尔生物科技有限公司;印度墨汁:北京索宝来科技有限公司;小鼠T N F 及I L E L I S A试剂盒:长沙达尔锋生物科技有限公司;碳酸钠及其他化学试剂:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;雄性昆明小白鼠:体重()g,生产许可证号为S C X K(湘),湖南斯莱克景达实验动物有限公司.主要仪器霉菌培 养 箱:M J (F)I型,上 海 一 恒 科 技 有 限公司;可见分光光度计:G型,上海佑科仪器仪表有限公司;电子天平
14、:F A L型,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;全自动五分类血液细胞分析仪:B C 型,深圳开立生物医疗科技股份有限公司;酶标 仪:WD A型,杭 州 汇 尔 仪 器 设 备 有 限公司.试验方法冠突散囊菌发酵液制备用接种针接种一环冠突散囊菌至M Y液体培养基,恒温摇床下 r/m i n培养 d,将发酵完成的组织液进行破碎匀浆,即为高剂量冠突散囊菌原液(质量浓度为 m g/m L).将原液用无菌蒸馏水分别稀释,倍,所得溶 液即 为 中剂 量(m g/m L)和低剂量(m g/m L)冠突散囊菌发酵液,于贮藏备用.冠突散囊菌与茶多酚混合物制备确定茶多酚最佳灌胃剂量为 m g/k gB W.将 m
15、g的茶多酚分别加入 m L低、中、高剂量的冠突散囊菌发酵液中,并用无菌玻璃棒充分搅拌至茶多酚完全溶解,即配成低、中、高剂量冠突散囊菌与茶多酚混合物,于 贮藏待用.试验设计小鼠于()、湿度 下适应性喂养周,期间可自由摄食和饮水.将 只小鼠随机分为组,每组只,分别是正常组(N组)、模型组(C组)、茶多酚组(T组)、低剂量冠突散囊菌茶多酚组(T L组)、中剂量冠突散囊菌茶多酚组(TM组)、高剂量冠突散囊菌茶多酚组(TH组).试验前d,正常组小鼠每天腹腔注射m L生理盐水,其他组每天腹腔注射m L环磷酰胺(m g/k gBW)以建立免疫低下模型.第 天,试验组(T组、T L组、TM组、TH组)每天灌胃
16、m L相应溶液,模型组和正常组每天灌胃等体积无菌蒸馏水,试验期间各组小鼠自由饮水和采食.干预试验结束后,称重,眼球采血于抗凝管,随后颈椎脱颈处死,取出完整的脾脏和肝脏.血液检测小鼠干预结束后,隔日取眼球血于抗凝管,在全自动五分类血液细胞分析仪中检测血液指标,包括红细胞(R B C)、白细胞(WB C)及血小板(P L T)含量.每组个重复.脾脏指数测定小鼠处死后,收集脾脏并用生理盐水洗净,用滤纸拭去组织表面多余水分并称重.使用处死时小鼠体重计算其相对重量,每组个重复.并按式()计算脾脏指数.IGG,()式中:I 脾脏指数,m g/g;G 脾脏重量,m g;G 体重,g.碳廓清试验参照陈汀等 的
17、方法并修改.小鼠末次灌胃h后,经尾静脉注射m L/g的印度墨汁.等待,m i n后,从眼内眦静脉丛取血 L,并立即将其加入到m L的N aC O溶液中,每组个重复.用酶标仪测定O D n m值,以吞噬系数表示小鼠碳廓清能力,按式()、式()计算相关系数.Kl gO D l gO Dt,()aGGG()K,()式中:|V o l ,N o 彭颖:冠突散囊菌与茶多酚复合物对免疫抑制小鼠的保护作用K 碳粒廓清指数;O D、O D 等待,m i n时,血液样本所测的O D n m值;t 两次取血样的时间差,m i n;a 吞噬系数;G 肝脏重量,m g.半数溶血值测定小鼠末次灌胃h后,经腹腔对每只小鼠
18、注射 m L体积分数为 的S R B C进行免疫.d后,摘眼球取血,室温静置h后离心(r/m i n离心 m i n),收集血清,每组个重复.按式()计算小鼠半数溶血值.HC O DnO D,()式中:HC 半数溶血值;O D n m处样本光密度值;O D n m处S R B C半溶血时的光密度值;n 稀释倍数.迟发 型变 态 反 应(D TH)测 定采 用 足 趾 增 厚法.小鼠灌胃结束后,经小鼠腹腔注射m L体积分数为的S R B C致敏d,取小鼠左后足趾测量其厚度,重复测次.于同一部位注射 L体积分数为 的S R B C,h后测量左后足趾厚度,重复测次.用攻击前后同一部位足趾厚度差表示迟
19、发型变态反应程度,每组个重复.细胞因子测定采用双抗体夹心E L I S A法测定血清I L 和TN F 质量浓度,根据试剂盒说明书进行操作,每组个重复.数据分析结果用平均数标准差表示,采用S P S S 软件对多组计量数据进行单因素方差分析,组间比较采用t检验,字母不同表示组间差异显著(P).结果与分析对小鼠外周血细胞数的影响由图可知,与N组相比,C组小鼠在WB C水平上显著下降(P),说明环磷酰胺免疫抑制模型建模成功.相对C组,T L、TM、TH组的小鼠白细胞数目显著提高,但对R B C、P L T水平无明显作用.张敏佳等 研究表明,环磷酰胺致使小鼠外周WB C计数显著下降,但经豌豆肽干预后
20、可恢复该指标水平.用茶多酚干预免疫低下小鼠仅对白细胞有显著提升(P),而对红细胞及血小板无明显影响,与肖红艳等 的结果一致.说明茶多酚对血细胞无负面作用,不影响动物健康,茶多酚能提高免疫抑制小鼠WB C水平恢复,但与不同浓度的冠突散囊菌之间无协同作用.图冠突散囊菌发酵液配伍茶多酚对小鼠外周血细胞计数的影响F i g u r eE f f e c t so f t e ap o l y p h e n o l sc o m b i n e dw i t hEc r i s t a t u mf e r m e n t a t i o nb r o t ho np e r i p h e r a
21、l b l o o dc e l l c o u n t i nm i c e对小鼠脾脏指数的影响由图可知,与N组相比,C组及试验组小鼠的脾脏指数均显著升高(P).与C组相比,试验组小鼠的脾脏指数无显著性变化.长期使用环磷酰胺会导致免疫细胞发育受阻,并对肝、肾等器官造成损伤.徐光沛等 证实了环磷酰胺对脾脏器官存在生物毒性,降低了小鼠的脾脏指数.这可能是机体免疫应激的一种表现,在短时间刺激下,激化机体的免疫防御反应,诱导免疫器官产生免疫因子来抵御外来刺激.也可能是环磷酰胺在给药后期,小鼠出现免疫亢进现象,导致免疫指标有回升现象甚至超过正常水平.对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响由图可知,与N组相比,C
22、组小鼠巨噬细胞的吞噬指数显著下降(P),说明环磷酰胺对小鼠的巨噬细胞功能具有抑制作用.T组小鼠在茶多酚作用下,提高了巨噬细胞的吞噬指数(P),表明茶多酚能缓解环磷酰胺的免疫毒性.郭春宏等 研究发现,茶多酚对小鼠巨噬细胞具有显著增殖作用,证实了茶多酚具有增强免疫的生物活性,与试验结果一致.与C组相比,T L、TM和TH组具有恢复吞噬指数的效果(P).据营养与活性NUT R I T I ON&A C T I V I T Y总第 期|年月|图冠突散囊菌发酵液配伍茶多酚对小鼠脾脏指数的影响F i g u r eE f f e c t so ft e ap o l y p h e n o l sc o
23、m b i n e dw i t hEc r i s t a t u mf e r m e n t a t i o nb r o t ho ns p l e e ni n d e xi nm i c e图冠突散囊菌发酵液与茶多酚配伍对环磷酰胺处理小鼠巨噬细胞免疫功能的影响F i g u r eE f f e c t so fEc r i s t a t u mf e r m e n t a t i o n b r o t hc o m b i n a t i o n w i t h t e a p o l y p h e n o l s o n t h em o n o n u c l e a
24、 rm a c r o p h a g ei mm u n ef u n c t i o ni nc y c l o p h o s p h a m i d e t r e a t e dm i c e文献 报道,冠突散囊菌发酵液对小鼠巨噬细胞增殖有一定作用,且与木霉混合发酵对巨噬细胞的增殖效果更好.说明冠突散囊菌可提高小鼠的免疫活性,在益生菌或益生元的互作下保护小鼠的免疫功能更为显著.因此,冠突散囊菌与茶多酚互配组、茶多酚组均能明显改善环磷酰胺毒副作用,可提高小鼠的免疫防御作用.对小鼠血清溶血素水平的影响由图可知,溶血素显著增加,提示机体体液免疫的防御能力增强.环磷酰胺显著降低了小鼠半数溶血
25、值,相比N组下降了 (P),但T组与C组并无显著差异,可能是茶多酚对小鼠半数溶血值的恢复无明显作用.中、高剂量的冠突散囊菌与茶多酚复合干预后,小鼠能恢复半数溶血值水平,与C组相比,TM、TH组小鼠体内溶血素水平分别提高了 ,.前期研究表明,中、高剂量的冠突散囊菌发酵液有助于免疫抑制小鼠溶血素水平的恢复.李敏等 研究发现,中、高剂量的茶多酚灵芝、姬松茸、黄芪多糖复合剂具有升高半数溶血值的作用.综上,环磷酰胺抑制了小鼠血清中的图冠突散囊菌与茶多酚配伍对环磷酰胺处理小鼠半数溶血值的影响F i g u r eE f f e c t so fEc r i s t a t u mf e r m e n t
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