供应商来源的实验大鼠和小鼠微生物监测结果分析:以复旦大学实验动物科学部为例.pdf
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1、DOI:10.12300/j.issn.1674-5817.2023.060实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineAug.2023,43(4)黄 缨,医学博士,高级实验师,执业兽医资格(兽医全科类),现任复旦大学实验动物科学部实验动物质量监测和基因操作平台负责人。曾任美国洛克菲勒大学研究助理、英国阿伯丁大学医学院客座讲师。主要从事实验动物微生物质量监测、小鼠胚胎操作或转基因相关操作,以及疾病动物模型与神经系统疾病发生机制研究等工作,同时承担复旦大学实验动物学课程教学工作。主持国家自然科学基金青年项目1项,参与国家自然科学基金、科
2、技部国家新药创制和科技部 973 计划等多个科研项目。作为第一作者或通信作者在Molecular Psychiatry、Molecular Brain等国内外学术期刊发表学术论文8篇,并以副主编身份参与编写教材实验动物学1部。供应商来源的实验大鼠和小鼠微生物监测结果分析:以复旦大学实验动物科学部为例黄缨,韦思羽,蔡 莉,强苏静,李冬婷,丁玉强(复旦大学实验动物科学部,上海200032)摘要 目的对供应商来源的实验大鼠、小鼠进行常规微生物监测,为实验动物设施科学管理提供重要依据,确保相关实验结果的可靠性。方法以复旦大学实验动物科学部为例,在2021年4月到2023年4月间,按照单纯随机抽样原则,
3、对来自7家供应商的大鼠、小鼠进行微生物质量抽检。具体参照国家标准中SPF级实验动物必须排除的微生物指标及其检测方法进行。结果抽检动物的检测总合格率为80.36%。其中SPF级大鼠抽检合格率为52.63%,SPF级近交系小鼠抽检合格率为82.76%,SPF级远交系小鼠抽检合格率为86.67%,SPF级免疫缺陷小鼠抽检合格率为86.36%。检测不合格的细菌学指标集中在金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌和啮齿杆菌H型,检出率分别为10.76%、3.16%、2.53%和0.63%。不合格的血清学指标为仙台病毒,发生率为2.53%。此外,除国家标准规定SPF级小鼠必须排除的微生物指标外,还在近交系
4、小鼠中检测到阿米巴原虫和肠杆菌属菌株;在免疫缺陷小鼠中检测到产酸性克雷伯杆菌,检出率分别为1.15%、2.30%和4.55%。结论供应商来源的大小鼠动物中存在一定的病原体感染发生率,相关动物设施有必要强化实验动物微生物监测,确保接收和饲养动物的质量,这对提高实验结果准确性和保护实验动物从业人员的职业健康具有重要意义。关键词 微生物;监测;供应商;实验动物质量;大鼠;小鼠中图分类号 Q95-33 文献标志码 A 文章编号 1674-5817(2023)04-0347-08Microbiological Monitoring Analysis of Laboratory Rats and Mice
5、 from Vendors:Department of Laboratory Animal Science of Fudan University as an ExampleHUANG Ying,WEI Siyu,CAI Li,QIANG Sujing,LI Dongting,DING Yuqiang(Department of Laboratory Animal Science,Fudan University,Shanghai 200032,China)Correspondence to:HUANG Ying(ORCID:0009-0001-4460-4311),E-mail:ying_A
6、BSTRACT Objective Conduct routine microbiological monitoring of laboratory rats and mice from vendors to provide an important basis for the scientific management of laboratory animal facility and ensure the reliability of relevant experimental data obtained from laboratory animals.Methods Taking the
7、 Department of Laboratory Animal Science of Fudan University as an example,between April 2021 and April 2023,rats and mice purchased from 7 vendors were sampled for microbiological quality according to the principle of simple random sampling on the arrival days of animal delivery.Then,surveillance t
8、ests were 华东会议优秀论文展 Excellent Papers at the East China Conference第一作者 黄 缨(1974),女,博士,高级实验师,研究方向:疾病动物模型与神经系统疾病发生机制。E-mail:ying_。ORCID:0009-0001-4460-431347实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineAug.2023,43(4)conducted to examine the microbiological contaminations according to the nationa
9、l standards of SPF laboratory animals.Results The total qualified rate was 80.36%,with 52.63%in SD rat,82.76%in inbred mice,86.67%in outbred mice and 86.36%in immunodeficient mice in details.The most frequent bacteria isolated were Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Klebsilla pneumoniae an
10、d Rodentibacter heylii,and their detection rates were 10.76%,3.16%,2.53%and 0.63%,respectively.Serological assays demonstrated the highest prevalence for virus was Sendai virus,and the detection rate was 2.53%.In addition to the pathogens those must be excluded from SPF rodents,Entamoeba muris and E
11、nterobacter spp.were also detected in inbred mice,and Klebsiella oxytoca was detected in immunodeficient mice,with the detection rates of 1.15%,2.30%and 4.55%,respectively.Conclusion There are certain incidences of pathogen infections in laboratory rats and mice from vendors,and an efficient microbi
12、ological monitoring of laboratory animals should be implemented in animal facilities,in order to eliminate pathogen infections in laboratory animals,which is required for improving the accuracy of research results and protecting the occupational health of laboratory animal practitioners as well.Key
13、words Microbiology;Monitoring;Vendor;Laboratory animal quality;Rat;Mouse病原体感染会对实验动物健康造成很大损害,也会给科学研究的结果分析带来不确定性。部分感染实验动物的病原体还可同时感染人,因此致病微生物的存在会给实验动物从业人员(包括所有使用实验动物的研究人员和接触实验动物的饲养人员、管理人员)带来健康风险和生物安全隐患1-2。实验动物微生物监测是指利用有效实验方法对实验动物微生物状态进行检测3,是实验动物行业管理中一个非常重要的环节,目前已有一系列的法律、法规和标准加以规范性约束和指导4。生物医学研究使用的实验动物中,
14、有相当数量是购自具有一定生产规模和严格管理措施的实验动物供应商。为了更好地对研究者使用的实验动物进行质量评估,保证所用实验动物的健康质量以及减少潜在生物危害风险,复旦大学实验动物科学部对近3年来购自不同供应商的实验大鼠、小鼠,在购入当天进行随机抽样检测,旨在为加强设施内实验动物的微生物质量管理提供依据。1材料与方法1.1动物标本来源及抽样方法所有动物检测标本均随机抽取于 2021 年 4 月2023年4月复旦大学实验动物科学部从7家实验动物供应商购入的实验大鼠、小鼠。这些供应商均具备实验动物生产许可证,其中4家位于上海,其余3家分别位于江苏、浙江和北京。1.2动物抽样包装、标本采集与检测项目在
15、收到订购动物的当天,单纯随机抽样,然后将所抽取的动物按SPF级别进行包装后,运送至标本采样实验室。参照国家标准GB 14922.12001实验动物 寄生虫学等级及监测及GB 14922.22011实验动物 微生物学等级及监测,挑选SPF级大鼠、小鼠必须排除项目,包括细菌、病毒和寄生虫指标。1.3检测方法与结果判定体外寄生虫及体内蠕虫、原虫指标的检测和结果判定分别参照国家标准GB/T 18448.12001 实验动物 体外寄生虫检测方法、GB/T 18448.62001实验动物 蠕虫检测方法、GB/T 18448.92001实验动物 肠道溶组织内阿米巴检测方法 和 GB/T 18448.1020
16、01肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法进行。细菌学指标检测分别参照 GB/T 14926.12001实验动物 沙门菌检测方法、GB/T 14926.62001实验动物 支气管鲍特杆菌检测方法、GB/T 14926.92001 实 验 动 物 鼠 棒 状 杆 菌 检 测 方 法、GB/T 14926.122001 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌检测方法、GB/T 14926.132001实验动物 肺炎克雷伯杆菌检测方法、GB/T 14926.142001实验动物 金黄色葡萄球菌检测方法和GB/T 14926.172001实验动物 绿脓杆菌检测方法进行标本采集和培养接种。采集气管分泌物或回盲肠部内容物,接种于特
17、定培养基/板后(表1),37 培养24 h,然后根据所检测指标的菌落生长特点(表1),再挑选可疑菌落接种于特定培养板(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司、北京陆桥技术股份有限公司),放置于细菌培养箱(购自德国Memmert公司,型号 IN110)之中,进行37 增菌培养。24 h后提取菌落DNA,并利用细菌16 S rDNA序列特点结合分子生物学技术,对细菌进行种属鉴348实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineAug.2023,43(4)定5。针对16 S区域的特异性PCR引物正向引物序列为5-AGAGTTTGATCCTGGCTC
18、AG-3,反向引物序列为5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,对应扩增产物长度为1.5 kb。其余检测指标参照GB/T 14926.502001实验动物酶联免疫吸附试验原理,采用CO2吸入安乐死或戊巴比妥钠(购自美国 Sigma 公司)溶液腹腔注射(1%剂量,30 mg/kg体重)法深度麻醉动物后,采集动物血液,室温静置30 min后以4 000 r/min速率离心20 min,分离得到血清,再利用商用酶联免疫反应试剂盒(购自苏州西山生物技术有限公司)进行针对性检 测 操 作,并 利 用 酶 标 仪(购 自 德 国 Berthold Technologies公司,型号Tristar
19、5)扫描结果。所有阳性标本都会进行二次检测以确认结果,排除意外因素产生的假阳性。本研究实验方案经复旦大学 实 验 动 物 科 学 部 动 物 伦 理 委 员 会 审 核 批 准(202304018Z)。1.4图片采集及作图病原体图片由显微镜(购自日本 Olympus 公司,型号SC180或SZ61)采集拍摄。检测合格率=抽检合格动物数/抽检动物总数100%。病原体检出率=携带有病原体的动物数/抽检动物总数100%。通过GraphPad Prism 8和Adobe Photoshop CC 2019软件进行结果作图。2结果2.1抽检合格率近3年一共抽检158只SPF级动物,其中SD大鼠19只,近
20、交系小鼠87只,远交系小鼠30只,免疫缺陷表1 SPF级大鼠、小鼠必须排除细菌培养及相对应的菌落特征汇总Table 1 Colony characteristics and Gram nature of bacteria excluded in SPF mice/rats on nutrient agar plates细菌Bacteria支气管鲍特杆菌Bordetella bronchiseptica鼠棒状杆菌Corynebacterium kutscheri嗜肺巴斯德杆菌Pasteurella pneumotropica沙门菌Salmonella spp.金黄色葡萄球菌Staphylococ
21、cus aureus肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa采样动物Animal大鼠大鼠、小鼠大鼠、小鼠大鼠、小鼠大鼠、小鼠大鼠、小鼠大鼠、小鼠革兰染色Gram staining-+-+-培养物质Sample呼吸道分泌物呼吸道分泌物呼吸道分泌物回盲肠部内容物回盲肠部内容物回盲肠部内容物回盲肠部内容物第一天接种Inoculation on day 1培养基Culture medium血平板DHL平板血平板血平板DHL平板高盐甘露醇DHL平板NAC液37 培养24 h后的典型菌落特点Colony characteristics af
22、ter 24 h at 37 直径Diameter/mm1210.51211513颜色/色泽Color/luster灰白色无色半透明白色无光泽灰白色或露滴样无色半透明,带黑心或全黑黄色凸起淡粉色,大而隆起浑浊均匀生长溶血性Hemolysis轻微-溶血/-溶血-溶血,或轻微-溶血/其他Other/触之较硬,不易乳化聚集时质地似奶油表面光滑湿润周边培养基从红色变黄色光滑湿润,呈黏液脓汁状菌落扁平,可产绿色色素第二天再接种Inoculation on day 2培养基Culture medium血平板血平板血平板血平板血平板血平板NAC平板37 培养24 h后是否-溶血-Hemolytic reac
23、tion after 24 h at 37 否否否否是(白或金黄圆形凸起菌落)否/注:+,阳性;-,阴性;/,不适合或没有需要特别说明的特性;DHL,胆硫乳琼脂;NAC,N-乙酰-L-半胱氨酸。Note:+,positive;-,negative;/,unsuitable or no special characteristics;DHL,deoxycholate hydrogen sulfide lactose;NAC,N-acetyl-L-cysteiner.349实验动物与比较医学 Laboratory Animal and Comparative MedicineAug.2023,43
24、(4)小鼠22只。检测了SPF级大鼠、小鼠必须排除的全部病原体指标,抽检动物检测总合格率为 80.38%。其中,SD大鼠、近交系小鼠、远交系小鼠和免疫缺陷小鼠的抽检合格率分别为 52.63%、82.76%、86.67%和86.36%。2.2各种病原体检出率在对抽检动物进行体内外采样后,显微镜下未观察到体外节肢动物,也未发现有蠕虫、纤毛虫或鞭毛虫。采用培养法及结合分子生物学方法对包括沙门菌、鼠棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜肺巴斯德杆菌(包括嗜肺啮齿杆菌和啮齿杆菌H型)和支气管鲍特杆菌这8种细菌学指标进行检测时,发现有17只动物体内检出金黄色葡萄球菌,5只动物检出绿脓杆菌,
25、4只动物检出肺炎克雷伯杆菌,1只动物体内检测出啮齿杆菌H型,不合格指标的检出率分别为 10.76%、3.16%、2.53%和0.63%(表2,图1)。其中,近交系小鼠中,肺炎克雷伯杆菌和金黄色葡萄球菌的检出率分别为2.30%和14.94%;远 交 系 小 鼠 中,绿 脓 杆 菌 的 检 出 率 为13.33%;免疫缺陷小鼠中,肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌的检出率分别为9.09%和4.55%;SD大鼠中,金黄色葡萄球菌和啮齿杆菌 H 型的检出率分别为 21.05%和5.26%(表3)。表2 20212023年供应商来源的SPF级大鼠、小鼠必须排除的病原体指标检测结果Table 2 Pathogen
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