钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 2050钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性郑传奇1,令狐美林2,舒忠泽1,汤鑫鑫2,周佳佳1,苏荣荣1,陈华1*(1黔西南州农业林业科学研究院,贵州兴义562400;2贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025)摘要:【目的】分离鉴定木霉属有益菌株,探索其对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果,为木霉属真菌的开发利用及辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的生物防治提供理论支持。【方法】采用组织分离法从鱼腥草根际土壤中分离、筛选木霉属有益菌株,通过形态学和内转录间隔区(ITS)测序确定其分类地位,利用两点对峙法、生长速率法、平板对扣法等测试木霉菌菌丝体、小分子代谢
2、产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果。【结果】采用组织分离法从鱼腥草根际土壤中分离纯化获得单一菌株,记为ZQ202104,结合形态特征和分子生物学鉴定结果,将菌株ZQ202104鉴定为钩状木霉(Trichoderma hamatum)。在对峙培养下,菌株ZQ202104对辣椒炭疽菌的抑制率为59.40%,对薏苡黑粉菌的抑制率为74.01%。生长速率法测定结果显示,菌株ZQ202104菌液加入量为2、4和6 mL时均能很好地抑制辣椒炭疽菌及薏苡黑粉菌的生长,对辣椒炭疽菌的抑制率分别为57.57%、60.60%和65.15%,对薏苡黑粉菌的抑制率分别为71.42%、82.85%和85
3、.71%。菌株ZQ202104无菌发酵液的抑菌活性在发酵9 d时对辣椒炭疽菌的抑制率最高,为35.09%;发酵15 d时对薏苡黑粉菌的抑制率最高,为68.00%。菌株ZQ202104的挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的生长均具有抑制作用,抑制率分别为47.29%和82.95%。【结论】从鱼腥草根际土壤中分离到的钩状木霉菌菌株ZQ202104的菌丝体、小分子代谢产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌均具有抑制作用,特别是对薏苡黑粉菌的生长抑制效果明显,其生防机制可能是竞争作用与抗生作用相结合。菌株ZQ202104具有开发成薏苡黑粉菌抑菌剂的潜力。关键词:钩状木霉;分离鉴定;辣椒炭疽菌;薏苡黑
4、粉菌;抑菌活性中图分类号:S435.79;S436.418文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)07-2050-10收稿日期:2022-09-18基金项目:贵州省高层次创新人才项目(GCC2022027-1);黔西南州科技计划项目(2020-1-03);黔西南州现代山区特色农业关键技术研究与成果示范项目(2022-11,2022-18)通讯作者:陈华(1991-),https:/orcid.org/0000-0002-7329-2070,高级工程师,主要从事植物保护及农林有益微生物开发利用研究工作,E-mail:第一作者:郑传奇(1993-),https:/orcid.org/
5、0000-0001-8584-6256,主要从事中药及微生物菌药的开发利用研究工作,E-mail:Isolation,identification of Trichoderma hamatum anddetermination of its antibacterial activity on Colletotrichumcapsici and Ustilago coicisZHENG Chuan-qi1,LINGHU Mei-lin2,SHU Zhong-ze1,TANG Xin-xin2,ZHOU Jia-jia1,SU Rong-rong1,CHEN Hua1*(1Qianxinan Re
6、search Institute ofAgricultural and Forestry Sciences,Xingyi,Guizhou 562400,China;2Institute of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China)Abstract:【Objective】The purpose of the study was to isolate and identify beneficial strains of Trichoderma spp.,and to explore their inhibitor
7、y effects on Colletotrichum capsici and Ustilago coicis,so as to provide a theoretical supportfor the development and utilization of Trichoderma spp.and the biocontrol of pepper anthracnose and adlay smut disease.【Method】The beneficial strains of Trichoderma spp.were isolated and identified from the
8、 rhizosphere soil of Houttuyniaeherba by tissue isolation method.Its taxonomic status was determined by morphology and ribosomal transcription spacer(ITS)sequencing.The inhibitory effects of Trichoderma spp.mycelium,small molecule metabolites and volatile compo-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2
9、023,54(7):2050-2059ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.0177期20510引言【研究意义】木霉菌(Trichoderma spp.)隶属于半知菌门丛梗孢目丛梗孢科,是一类重要的生物防治真菌,广泛分布于植物种子、根际、叶围、球茎和土壤等环境中(Cummings et al.,2016),其生长速度快,适应能力强,能拮抗多种病原菌(伍晓丽等,2019;李月等,2022)。辣椒炭疽病是辣椒的主要病害之一,主要发生在夏季高温季节,多以分生孢子形式侵染辣椒的果实、茎、叶和果梗等导致
10、辣椒减产,严重时可使辣椒减产50%甚至更高(郑洁等,2021)。薏苡是一年生或多年生草本植物,为“药食同源”作物的典型代表(李晓凯等,2020),是黔西南州主要经济作物,薏苡黑粉病是严重影响薏苡产量和品质的病害之一,严重时发病率达50%100%,制约了薏苡产业的可持续发展。目前,无论是辣椒炭疽病还是薏苡黑粉病的防治均以化学农药为主,长期使用化学农药容易导致土壤板结、植物农残升高,使病原菌产生抗药性等(韩秀英等,2011)。而木霉菌不仅可以抑制植物病原菌的生长,而且能促进植物生长,提高作物的产量和品质,在现代绿色农业发展中被广泛使用(赵兴丽等,2020;蔺泽荣和朱海霞,2021)。近年来,随着研
11、究者对不同环境微生物丰度的深入研究,发现药用植物根际土壤中存在丰富的微生物,杨皓(2008)对丹参、川芎及鱼腥草等药用植物根际土壤真菌多样性进行研究,结果表明鱼腥草根际土壤含有丰富的真菌,木霉是其中分布较广泛的一个属;侯怡婷等(2020)研究药用植物根际土壤木霉群落组成和物种分布,结果表明药用植物根区土壤木霉物种分离频率最高。因此,从药用植物根际土壤中分离鉴定木霉菌,探索木霉属真菌对辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的防治效果,对辣椒和薏苡产业的健康可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】木霉属真菌种类繁多,生防机制复杂。常用作生防菌的木霉有绿木霉(T.virid)、棘孢木霉(T.asperellum)、
12、康氏木霉(T.koningir)、长枝木霉(T.longibrachia-tum)、哈茨木霉(T.harzianum)和钩状木霉(T.hama-tum)等(张广志等,2014),它们对烟草根腐病菌、棉花立枯病菌和瓜类枯萎病菌等具有显著的抑制作用(胡琼和刘茂泉,2019;殷全玉等,2022)。其生防机制有竞争作用(Contreras-Cornejo et al.,2016)、抗生作用、重寄生、诱导抗性、协同拮抗和分泌次生代谢产物等方式抑制植物病原菌的生长(刘青等,2019;张锋涛等,2021),如钩状木霉T382侵染拟南芥可诱导系统抗性,从而提高对灰葡萄孢菌(Botrytis cine-rea)
13、的抗性(Mathys et al.,2012);长枝木霉能深入病原菌的内部生长,与病原菌菌丝相互缠绕和交错,使部分病原菌菌丝细胞原生质浓缩和菌丝断裂(张瑾等,2014);哈茨木霉分泌的天冬氨酸蛋白酶P6281能提高哈茨木霉在植物病原真菌中的寄生能力(Deng et al.,2018)。近年来,国内外对哈茨木霉、长枝木霉及棘孢木霉的研究相对较多,对钩状木霉的主要集中在根际土壤定殖上,对其系统性的分离鉴定及生防效果研究报道较少。钩状木霉是木霉属中重要的一种有益菌,具有显著的抗生作用,可产生多种具有抗生作用的次生代谢产物,包括挥发性物质和非挥发性物质,王子晴等(2021)研究表明,钩状木nents
14、on C.capsici and U.coicis were tested by the two-point confrontation method,growth rate method and flat platebuckle method.【Result】A single strain was isolated and purified from the rhizosphere soil of H.herba by tissue isolationmethod and recorded as ZQ202104.The results of morphology characteristi
15、cs and molecular biology identification showedthat strain ZQ202104 was T.hamatum.Under the confrontation culture,strain ZQ202104 had inhibitory effect on thegrowth of C.capsici and U.coicis,and the inhibition rates were 59.40%and 74.01%respectively.The results of growthrate assay showed that strain
16、ZQ202104 could inhibit the growth of C.capsici and U.coicis well when the filtrate was addedat the amounts of 2,4 and 6 mL,with the inhibition rates of 57.57%,60.60%and 65.15%against C.capsici and71.42%,82.85%and 85.71%against U.coicis,respectively.When fermented for 9 d,the bacteriostatic activity
17、of strainZQ202104 sterile fermentation broth showed the highest inhibition rate on C.capsici(35.09%).When the fermentationwas performed for 15 d,the inhibition rate on U.coicis was the highest(68.00%).The volatile components of strainZQ202104 had inhibitory effects on the growth of C.capsici and U.c
18、oicis,and the inhibition rates were 47.29%and82.95%respectively.【Conclusion】The mycelium,small molecule metabolites and volatile components of T.hamatumstrain ZQ202104 isolated from the soil in the rhizosphere of H.herbahas inhibitory effects on C.capsici and U.coicis,and the growth inhibitory effec
19、t is obvious especially for U.coici.The biocontrol mechanism may be a combination ofcompetition and antibacterial effects.Strain ZQ202104 has the potential to be developed into a bacteriostatic agent forU.coicis.Key words:Trichoderma hamatum;isolation and identification;Colletotrichum capsici;Ustila
20、go coicis;antibacte-rial activityFoundation items:Guizhou High-level Innovation Talent Project(GCC2022027-1);Qianxinan Science and Techno-logy Project(2020-1-03);Key Technology Research and Achievement Demonstration Project of Modern Special Agricul-ture in Qianxinan(2022-11,2022-18)郑传奇等:钩状木霉的分离鉴定及对
21、辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性54卷南 方 农 业 学 报 2052霉挥发性物质对菌核病菌的抑制效果优于拟康氏木霉和哈茨木霉;Velasco等(2021)研究表明,钩状木霉能提高不同绿叶芸苔类蔬菜的产量及其硫代葡萄糖苷含量和抗氧化能力;胡娴等(2022)研究表明,钩状木霉发酵液氯仿提取物对腐皮镰刀菌具有很好的抑制作用。此外,钩状木霉还具有吸附重金属的作用,李媛媛(2018)对钩状木霉去除重金属Cr的研究发现,钩状木霉对Cr的去除率达90%以上。【本研究切入点】钩状木霉是当前最具开发潜力的生防菌种之一,而目前辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的防治主要以物理防治和化学防治为主,采用木霉属等生防菌进行生物防
22、治的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用组织分离法从鱼腥草(Houttuyniae herba)根际土壤中分离、筛选木霉属有益菌株,并通过形态学和内转录间隔区(ITS)测序确定其分类地位,利用两点对峙法、生长速率法及平板对扣法等研究所分离菌株的菌丝体、无菌发酵液中小分子代谢产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果,以期为木霉属真菌的开发利用及辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的生物防治提供理论支持。1材料与方法1.1试验材料木霉菌从采自贵州省黔西南州册亨县者孟村鱼腥草种植基地的鱼腥草根际土壤中分离获得。采样时小心挖出鱼腥草根茎,抖动去土,保留附着在根茎上带白色菌丝的少量土样,装入无菌采样袋,标
23、记后转移至实验室,置于4 冰箱保存。辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)由贵州省农业科学院辣椒研究所保存提供,薏苡黑粉菌(Ustilago coicis)由黔西南州农业林业科学研究院中药材研究所分离、鉴定并保存。供试培养基为PDA培养基(取200 g马铃薯放入适当水中煮20 min后过滤,滤液加入琼脂粉15 g,葡萄糖20 g,定容至1000 mL)和PDB培养基(PDA培养基不加琼脂,其余配置相同)。1.2试验方法1.2.1木霉菌的分离与形态鉴定采用组织分离法分离纯化菌落:将鱼腥草根际土壤置于超净工作台,用灭菌后的镊子小心夹起土壤中白色菌丝,置于PDA培养基中培养,观察
24、菌丝生长情况,待长出白色菌丝时,挑取菌丝转入下一个干净的PDA培养基中,经23次转皿即得纯化的单一菌株。对单一菌落进行形态观察,并用光学显微镜观察菌丝情况。厚垣孢子观察:将分离纯化的菌落用6 mm打孔器打孔后,每瓶分别取2块接种于250 mL三角瓶中,每瓶分装PDB培养基100 mL,置摇床上28 下140 r/min振荡培养5 d,经8层纱布过滤,取滤液离心后收集厚垣孢子于光学显微镜下观察。1.2.2木霉菌分子鉴定总DNA提取及ITS检测:将纯化后的木霉菌株置于固体PDA中培养5 d左右,刮取菌丝,按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司 说明书提取总DN
25、A,紫外分光光度法检测DNA浓度,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。将所提取DNA稀释至2050 ng/mL备用,对ITS序列进行PCR扩增。正向引物ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3,反向引物ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反应体系25.0 L:10Buffer 2.5 L,dNTP(各2.5 mmol/L)1.0 L,Taq DNA 聚 合 酶 0.2 L,10 mol/L正、反向引物各0.5 L,DNA模板0.5 L,加ddH2O至25.0 L。扩增程序:94 预变性4 min;94 45 s、55 45 s、72 75 s,进行
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