钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 2050钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性郑传奇1，令狐美林2，舒忠泽1，汤鑫鑫2，周佳佳1，苏荣荣1，陈华1*（1黔西南州农业林业科学研究院，贵州兴义562400；2贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）摘要：【目的】分离鉴定木霉属有益菌株，探索其对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果，为木霉属真菌的开发利用及辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的生物防治提供理论支持。【方法】采用组织分离法从鱼腥草根际土壤中分离、筛选木霉属有益菌株，通过形态学和内转录间隔区（ITS）测序确定其分类地位，利用两点对峙法、生长速率法、平板对扣法等测试木霉菌菌丝体、小分子代谢产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果。【结果】采用组织分离法从鱼腥草根际土壤中分离纯化获得单一菌株，记为ZQ202104，结合形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株ZQ202104鉴定为钩状木霉（Trichoderma hamatum）。在对峙培养下，菌株ZQ202104对辣椒炭疽菌的抑制率为59.40%，对薏苡黑粉菌的抑制率为74.01%。生长速率法测定结果显示，菌株ZQ202104菌液加入量为2、4和6 mL时均能很好地抑制辣椒炭疽菌及薏苡黑粉菌的生长，对辣椒炭疽菌的抑制率分别为57.57%、60.60%和65.15%，对薏苡黑粉菌的抑制率分别为71.42%、82.85%和85.71%。菌株ZQ202104无菌发酵液的抑菌活性在发酵9 d时对辣椒炭疽菌的抑制率最高，为35.09%；发酵15 d时对薏苡黑粉菌的抑制率最高，为68.00%。菌株ZQ202104的挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的生长均具有抑制作用，抑制率分别为47.29%和82.95%。【结论】从鱼腥草根际土壤中分离到的钩状木霉菌菌株ZQ202104的菌丝体、小分子代谢产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌均具有抑制作用，特别是对薏苡黑粉菌的生长抑制效果明显，其生防机制可能是竞争作用与抗生作用相结合。菌株ZQ202104具有开发成薏苡黑粉菌抑菌剂的潜力。关键词：钩状木霉；分离鉴定；辣椒炭疽菌；薏苡黑粉菌；抑菌活性中图分类号：S435.79；S436.418文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）07-2050-10收稿日期：2022-09-18基金项目：贵州省高层次创新人才项目（GCC2022027-1）；黔西南州科技计划项目（2020-1-03）；黔西南州现代山区特色农业关键技术研究与成果示范项目（2022-11，2022-18）通讯作者：陈华（1991-），https:/orcid.org/0000-0002-7329-2070，高级工程师，主要从事植物保护及农林有益微生物开发利用研究工作，E-mail：第一作者：郑传奇（1993-），https:/orcid.org/0000-0001-8584-6256，主要从事中药及微生物菌药的开发利用研究工作，E-mail：Isolation，identification of Trichoderma hamatum anddetermination of its antibacterial activity on Colletotrichumcapsici and Ustilago coicisZHENG Chuan-qi1，LINGHU Mei-lin2，SHU Zhong-ze1，TANG Xin-xin2，ZHOU Jia-jia1，SU Rong-rong1，CHEN Hua1*（1Qianxinan Research Institute ofAgricultural and Forestry Sciences，Xingyi，Guizhou 562400，China；2Institute of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to isolate and identify beneficial strains of Trichoderma spp.，and to explore their inhibitory effects on Colletotrichum capsici and Ustilago coicis，so as to provide a theoretical supportfor the development and utilization of Trichoderma spp.and the biocontrol of pepper anthracnose and adlay smut disease.【Method】The beneficial strains of Trichoderma spp.were isolated and identified from the rhizosphere soil of Houttuyniaeherba by tissue isolation method.Its taxonomic status was determined by morphology and ribosomal transcription spacer（ITS）sequencing.The inhibitory effects of Trichoderma spp.mycelium，small molecule metabolites and volatile compo-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（7）：2050-2059ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.0177期20510引言【研究意义】木霉菌（Trichoderma spp.）隶属于半知菌门丛梗孢目丛梗孢科，是一类重要的生物防治真菌，广泛分布于植物种子、根际、叶围、球茎和土壤等环境中（Cummings et al.，2016），其生长速度快，适应能力强，能拮抗多种病原菌（伍晓丽等，2019；李月等，2022）。辣椒炭疽病是辣椒的主要病害之一，主要发生在夏季高温季节，多以分生孢子形式侵染辣椒的果实、茎、叶和果梗等导致辣椒减产，严重时可使辣椒减产50%甚至更高（郑洁等，2021）。薏苡是一年生或多年生草本植物，为“药食同源”作物的典型代表（李晓凯等，2020），是黔西南州主要经济作物，薏苡黑粉病是严重影响薏苡产量和品质的病害之一，严重时发病率达50%100%，制约了薏苡产业的可持续发展。目前，无论是辣椒炭疽病还是薏苡黑粉病的防治均以化学农药为主，长期使用化学农药容易导致土壤板结、植物农残升高，使病原菌产生抗药性等（韩秀英等，2011）。而木霉菌不仅可以抑制植物病原菌的生长，而且能促进植物生长，提高作物的产量和品质，在现代绿色农业发展中被广泛使用（赵兴丽等，2020；蔺泽荣和朱海霞，2021）。近年来，随着研究者对不同环境微生物丰度的深入研究，发现药用植物根际土壤中存在丰富的微生物，杨皓（2008）对丹参、川芎及鱼腥草等药用植物根际土壤真菌多样性进行研究，结果表明鱼腥草根际土壤含有丰富的真菌，木霉是其中分布较广泛的一个属；侯怡婷等（2020）研究药用植物根际土壤木霉群落组成和物种分布，结果表明药用植物根区土壤木霉物种分离频率最高。因此，从药用植物根际土壤中分离鉴定木霉菌，探索木霉属真菌对辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的防治效果，对辣椒和薏苡产业的健康可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】木霉属真菌种类繁多，生防机制复杂。常用作生防菌的木霉有绿木霉（T.virid）、棘孢木霉（T.asperellum）、康氏木霉（T.koningir）、长枝木霉（T.longibrachia-tum）、哈茨木霉（T.harzianum）和钩状木霉（T.hama-tum）等（张广志等，2014），它们对烟草根腐病菌、棉花立枯病菌和瓜类枯萎病菌等具有显著的抑制作用（胡琼和刘茂泉，2019；殷全玉等，2022）。其生防机制有竞争作用（Contreras-Cornejo et al.，2016）、抗生作用、重寄生、诱导抗性、协同拮抗和分泌次生代谢产物等方式抑制植物病原菌的生长（刘青等，2019；张锋涛等，2021），如钩状木霉T382侵染拟南芥可诱导系统抗性，从而提高对灰葡萄孢菌（Botrytis cine-rea）的抗性（Mathys et al.，2012）；长枝木霉能深入病原菌的内部生长，与病原菌菌丝相互缠绕和交错，使部分病原菌菌丝细胞原生质浓缩和菌丝断裂（张瑾等，2014）；哈茨木霉分泌的天冬氨酸蛋白酶P6281能提高哈茨木霉在植物病原真菌中的寄生能力（Deng et al.，2018）。近年来，国内外对哈茨木霉、长枝木霉及棘孢木霉的研究相对较多，对钩状木霉的主要集中在根际土壤定殖上，对其系统性的分离鉴定及生防效果研究报道较少。钩状木霉是木霉属中重要的一种有益菌，具有显著的抗生作用，可产生多种具有抗生作用的次生代谢产物，包括挥发性物质和非挥发性物质，王子晴等（2021）研究表明，钩状木nents on C.capsici and U.coicis were tested by the two-point confrontation method，growth rate method and flat platebuckle method.【Result】A single strain was isolated and purified from the rhizosphere soil of H.herba by tissue isolationmethod and recorded as ZQ202104.The results of morphology characteristics and molecular biology identification showedthat strain ZQ202104 was T.hamatum.Under the confrontation culture，strain ZQ202104 had inhibitory effect on thegrowth of C.capsici and U.coicis，and the inhibition rates were 59.40%and 74.01%respectively.The results of growthrate assay showed that strain ZQ202104 could inhibit the growth of C.capsici and U.coicis well when the filtrate was addedat the amounts of 2，4 and 6 mL，with the inhibition rates of 57.57%，60.60%and 65.15%against C.capsici and71.42%，82.85%and 85.71%against U.coicis，respectively.When fermented for 9 d，the bacteriostatic activity of strainZQ202104 sterile fermentation broth showed the highest inhibition rate on C.capsici（35.09%）.When the fermentationwas performed for 15 d，the inhibition rate on U.coicis was the highest（68.00%）.The volatile components of strainZQ202104 had inhibitory effects on the growth of C.capsici and U.coicis，and the inhibition rates were 47.29%and82.95%respectively.【Conclusion】The mycelium，small molecule metabolites and volatile components of T.hamatumstrain ZQ202104 isolated from the soil in the rhizosphere of H.herbahas inhibitory effects on C.capsici and U.coicis，and the growth inhibitory effect is obvious especially for U.coici.The biocontrol mechanism may be a combination ofcompetition and antibacterial effects.Strain ZQ202104 has the potential to be developed into a bacteriostatic agent forU.coicis.Key words：Trichoderma hamatum；isolation and identification；Colletotrichum capsici；Ustilago coicis；antibacte-rial activityFoundation items：Guizhou High-level Innovation Talent Project（GCC2022027-1）；Qianxinan Science and Techno-logy Project（2020-1-03）；Key Technology Research and Achievement Demonstration Project of Modern Special Agricul-ture in Qianxinan（2022-11，2022-18）郑传奇等：钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性54卷南 方 农 业 学 报 2052霉挥发性物质对菌核病菌的抑制效果优于拟康氏木霉和哈茨木霉；Velasco等（2021）研究表明，钩状木霉能提高不同绿叶芸苔类蔬菜的产量及其硫代葡萄糖苷含量和抗氧化能力；胡娴等（2022）研究表明，钩状木霉发酵液氯仿提取物对腐皮镰刀菌具有很好的抑制作用。此外，钩状木霉还具有吸附重金属的作用，李媛媛（2018）对钩状木霉去除重金属Cr的研究发现，钩状木霉对Cr的去除率达90%以上。【本研究切入点】钩状木霉是当前最具开发潜力的生防菌种之一，而目前辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的防治主要以物理防治和化学防治为主，采用木霉属等生防菌进行生物防治的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用组织分离法从鱼腥草（Houttuyniae herba）根际土壤中分离、筛选木霉属有益菌株，并通过形态学和内转录间隔区（ITS）测序确定其分类地位，利用两点对峙法、生长速率法及平板对扣法等研究所分离菌株的菌丝体、无菌发酵液中小分子代谢产物及挥发性成分对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果，以期为木霉属真菌的开发利用及辣椒炭疽病和薏苡黑粉病的生物防治提供理论支持。1材料与方法1.1试验材料木霉菌从采自贵州省黔西南州册亨县者孟村鱼腥草种植基地的鱼腥草根际土壤中分离获得。采样时小心挖出鱼腥草根茎，抖动去土，保留附着在根茎上带白色菌丝的少量土样，装入无菌采样袋，标记后转移至实验室，置于4 冰箱保存。辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）由贵州省农业科学院辣椒研究所保存提供，薏苡黑粉菌（Ustilago coicis）由黔西南州农业林业科学研究院中药材研究所分离、鉴定并保存。供试培养基为PDA培养基（取200 g马铃薯放入适当水中煮20 min后过滤，滤液加入琼脂粉15 g，葡萄糖20 g，定容至1000 mL）和PDB培养基（PDA培养基不加琼脂，其余配置相同）。1.2试验方法1.2.1木霉菌的分离与形态鉴定采用组织分离法分离纯化菌落：将鱼腥草根际土壤置于超净工作台，用灭菌后的镊子小心夹起土壤中白色菌丝，置于PDA培养基中培养，观察菌丝生长情况，待长出白色菌丝时，挑取菌丝转入下一个干净的PDA培养基中，经23次转皿即得纯化的单一菌株。对单一菌落进行形态观察，并用光学显微镜观察菌丝情况。厚垣孢子观察：将分离纯化的菌落用6 mm打孔器打孔后，每瓶分别取2块接种于250 mL三角瓶中，每瓶分装PDB培养基100 mL，置摇床上28 下140 r/min振荡培养5 d，经8层纱布过滤，取滤液离心后收集厚垣孢子于光学显微镜下观察。1.2.2木霉菌分子鉴定总DNA提取及ITS检测：将纯化后的木霉菌株置于固体PDA中培养5 d左右，刮取菌丝，按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司 说明书提取总DNA，紫外分光光度法检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。将所提取DNA稀释至2050 ng/mL备用，对ITS序列进行PCR扩增。正向引物ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，反向引物ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反应体系25.0 L：10Buffer 2.5 L，dNTP（各2.5 mmol/L）1.0 L，Taq DNA 聚 合 酶 0.2 L，10 mol/L正、反向引物各0.5 L，DNA模板0.5 L，加ddH2O至25.0 L。扩增程序：94 预变性4 min；94 45 s、55 45 s、72 75 s，进行30个循环；72 延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，对目标条带进行纯化和测序。ITS序列比对和系统发育树构建：将获得的真菌ITS序列在NCBI中进行BLAST检索比对，下载同源性较高的序列于MEGA 7.0中进行对位排列（Align by ClustalW），将排序后的序列导入MEGA 7.0进行最大似然法分析，选用自展法（Bootstrap）对系统发育进化树进行检测，自展重复次数设定为1000次。1.2.3木霉菌抑菌率测定采用平板对峙法测定木霉菌对病原菌的拮抗作用。在距离PDA平板（直径9 cm）边缘约8 mm的相对应2点上分别接种病原菌和木霉菌菌饼（直径6 mm）各1片，置于28 暗培养，培养26 d期间记录对峙条件下木霉菌与病原菌菌落的生长半径及非对峙条件下对照菌落的生长半径。木霉菌抑菌率（%）=（对照病原菌菌落半径-对峙培养的病原菌菌落半径）/对照病原菌菌落半径100。采用生长速率法测定木霉菌对病原菌的生长抑制率。将2个直径为6 mm的木霉菌菌饼接种于100 mL PDB培养液中，28 下140 r/min振荡培养5 d，经滤纸过滤后，分别取2、4和6 mL菌液加50 左右的PDA定容至50 mL，混匀倒平板，然后分别取直径为6 mm的病原菌菌饼接种于含不同体积木霉菌液的PDA培养基上，以不加木霉菌液的PDA培养基为对照，每处理3个重复，28 培养69 d。生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径100。1.2.4木霉菌无菌发酵液抑菌率测定取2个直径7期2053为6 mm的木霉菌菌饼接种于100 mL PDB培养液中，28 下140 r/min振荡培养，分别于培养7、9、11、13、15和17 d吸取发酵液置于灭菌离心管中，8000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 mol/L微孔滤膜过滤，即获得无菌发酵液。采用固体稀释法，待PDA培养基冷却至50 左右，将木霉菌无菌发酵液与培养基以1 9混合凝固，取直径为6 mm的2株病原菌接种于木霉菌无菌发酵液的PDA培养基上，以添加无菌水与培养基以1 9混合为对照，28 下培养79 d后测量各处理菌落直径，计算抑菌率。每处理3个重复。抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径100。1.2.5木霉菌挥发性物质抑菌活性测定采用平板对扣法测定（Muthukumar et al.，2011）。用6 mm打孔器分别打取木霉菌和病原菌菌饼接入PDA平皿中央，将接入病原菌的PDA培养基平皿倒扣于接种有木霉菌的PDA平皿中，以只接种病原菌而未接种木霉菌的倒扣平板为对照，于28 恒温培养箱中培养79 d。每处理3个重复。抑菌率计算同1.2.4。1.3统计分析试验数据利用Excel 2010进行整理，运用SPSS26.0进行统计分析，应用Duncan s新复极差法进行多重比较。采用Graphpad Prism 8.0作图，运用MEGA 7.0构建系统发育进化树。2结果与分析2.1木霉菌的分离、培养和鉴定采用组织分离法从鱼腥草根际土壤中分离纯化获得单一菌株，记为ZQ202104。菌株ZQ202104在PDA培养基上生长较快，培养3 d时半径为30 mm，6 d能长满整个平皿；菌落白色，棉絮状，菌丝具长主轴，透明，有隔，分支较多，平皿反面为淡黄色；培养8 d时形成少量浅黄色产孢簇，随着时间推移，产孢簇变为灰绿色；分生孢子梗35轮生，主枝粗状，波状弯曲，梗上半部具分支，呈钩状，瓶梗近球形至椭球形，分生孢子呈椭圆形，大小（1.182.02）m（1.732.85）m；厚垣孢子为浅绿色，呈椭球形，大小为（1.834.66）m（1.974.78）m（图1）。其形态特征与张广志等（2011）描述的钩状木霉一致。菌株ZQ202104的ITS片段经PCR扩增测序后，在NCBI中进行BLAST比对，以Aspergillus terreus为外群（姚晨虓等，2022），采用MEGA 7.0构建系统发育进化树。聚类分析发现，目标菌株ZQ202104与木霉属钩状木霉（T.hamatum）聚为一枝，具有较高的同源性，支持率高达99%（图2）。结合形态特征和分子生物学鉴定结果，将所分离获得的菌株ZQ202104图 1菌株ZQ202104的形态特征Fig.1Morphological characteristics of strain ZQ202104A：菌落形态正、反面；B：菌落产孢簇；C：厚垣孢子；D：分生孢子；E：菌丝；F：分生孢子梗和瓶梗。标尺=10 mA：Colony morphology on upper surface and lower surface；B：Colony spore-forming cluster；C：Chlamydospore；D：Conidia；E：Mycelium；F：Conidiophores and phialides.Bar=10 mABCDEF郑传奇等：钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性54卷南 方 农 业 学 报 2054图 2基于ITS序列构建的菌株ZQ202104系统发育进化树Fig.2Phylogenetic tree of strain ZQ202104 constructed based on ITS sequenceZQ202104鉴定为钩状木霉（T.hamatum）。2.2钩状木霉菌菌丝体对辣椒炭疽菌及薏苡黑粉菌的抑制效果对峙法测定结果（图3和表1）显示，对峙培养至3 d时，菌株ZQ202104的菌丝生长明显超过辣椒炭疽 菌 及 薏 苡 黑 粉 菌；对 峙 培 养 至 6 d 时，菌 株ZQ202104的菌丝侵入病原菌菌落，使病原菌菌丝体松散、发生溶解，出现面积萎缩等现象。生长速率法测定结果（表2）显示，菌株ZQ202104菌液加入量为2、4和6 mL时均能很好地抑制辣椒炭疽菌及薏苡黑粉菌的生长。2.3不同发酵时间下钩状木霉无菌发酵液抑菌活性菌株ZQ202104菌液发酵时间不同，产生的活性物质对供试2种病原菌的抑制效果也不同（图4和图5）。发酵时间为7 d时对薏苡黑粉菌有明显的抑制效果，随着发酵时间的延长，抑菌活性在15 d时达最大值，为68.00%，其后稍有下降，且对黑粉菌菌落形态影响较大，使菌落形态严重皱缩，皱褶明显。对于辣椒炭疽菌，随菌株ZQ202104菌液发酵时间的延长抑菌活性呈明显先升高后降低的趋势，发酵7 d时的抑制率为11.02%，抑菌活性在9 d时达最大值，为35.09%。表明钩状木霉发酵液产生的小分子代谢产物对薏苡黑粉菌有较强的抑制作用，对辣椒炭疽菌的抑制作用稍弱。2.4钩状木霉挥发性物质对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性菌株ZQ202104的挥发性物质对供试2种病原菌均具有抑制作用，但对薏苡黑粉菌的抑制效果远大于辣椒炭疽菌，其中对薏苡黑粉菌的抑制率高达82.95%，而对辣椒炭疽菌的抑制率仅为47.29%，二者间差异达显著水平（P0.05）（表3和图6）。3讨论木霉菌是一类重要的生防菌，不仅具有显著的抗植物病原菌作用，还具有解磷、土壤修复及促进植物生长等作用（Harman et al.，2012；胡娴等，2019），7期2055图 3菌株ZQ202104对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果Fig.3Inhibitory effects of strain ZQ202104 on C.capsici and U.coicisA：菌株ZQ202104对峙辣椒炭疽菌；B：菌株ZQ202104对峙薏苡黑粉菌；C：含菌株ZQ202104菌液的辣椒炭疽菌；D：含菌株ZQ202104菌液的薏苡黑粉菌；E、F、G、H为A、B、C、D对应的空白对照A：Strain ZQ202104 confronted C.capsici；B：Strain ZQ202104 confronted U.coicis；C：C.capsici fungal fermentation broth with strainZQ202104；D：U.coicis fungal fermentation broth with strain ZQ202104；E，F，G，H were blank controls corresponding toA，B，C，D respectively病原菌Pathogen辣椒炭疽菌C.capsici薏苡黑粉菌U.coicis菌液加入量（mL）Amount of bacterial solution added02460246抑制率（%）Inhibition rate-57.570.02f60.600.02e65.150.02d-71.420.04c82.850.01b85.710.02a表 2菌株ZQ202104菌液对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果Table 2Inhibitory effects of bacterial solution of strainZQ202104 on C.capsici and U.coicis病原菌Pathogen辣椒炭疽菌 C.capsici薏苡黑粉菌 U.coicis辣椒炭疽菌空白C.capsici blank control薏苡黑粉菌空白U.coicis blank control菌落半径（cm）Colony radius1.250.040.440.053.090.141.700.08抑制率（%）Inhibition rate59.400.01b74.010.04a-表 1对峙培养下菌株ZQ202104对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果Table 1Inhibitory effect of strain ZQ202104 on C.capsiciand U.coicis at confrontation culture同列数据后不同小写字母表示差异显著（P0.05）。表2和表3同Different lowercase letters in the same column indicated significant dif-ference（P0.05）.The same was applied in Table 2 and Table 3辣椒炭疽菌 C.capsici薏苡黑粉菌 U.coicis抑制率（%）Inhibition rate80.0060.0040.0020.000.007911131517发酵时间（d）Fermentation time图 4菌株ZQ202104不同发酵天数无菌发酵液对2种病原菌的抑制效果Fig.4Inhibitory effects of the sterile fermentation solution ofstrain ZQ202104 for different fermentation days againsttwo pathogens同种病原菌不同发酵天数图柱上不同小写字母表示差异显著（P0.05）Different lowercase letters on the bar of the same pathogen with diffe-rent fermentation days indicated significant difference（P0.05）在防治植物病害、预防土传病害和促进植物生长等方面均具有显著作用（Ryder et al.，2012；Metwallyand Al-Amri，2020），如哈茨木霉不仅能抑制土传病原菌水稻纹枯病菌和核盘菌的传播，还能促进植物生长和诱导植物产生抗性（Vinale et al.，2014）。目前，国内外研究木霉菌防御土传病原菌的报道较多，但有关炭疽菌和黑粉菌的生物防治报道较少。本研究从鱼腥草根际土壤中分离木霉菌，并结合形态学与ITS分子鉴定确定其分类地位。木霉属是一大属，同属不同种在形态学上差别不大，仅靠形态学结果确定木霉菌种间分类学地位难以令人信服，真菌ITS具有进化速度快、基因片段较小等优点，目前已广泛郑传奇等：钩状木霉的分离鉴定及对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑菌活性54卷南 方 农 业 学 报 2056应用于真菌属种间及部分种内水平的研究（和肖营等，2020）。本研究采用形态学与ITS分子鉴定结果表明，所分离菌株ZQ202104为钩状木霉，对分离的木霉进行产孢观察时发现，在相同培养温度下，光照能刺激钩状木霉产孢，与尤佳琪等（2022）的研究结果一致；另外，本研究发现，通过伤口刺激能促进钩状木霉分生孢子梗生长及分生孢子产生，此现象鲜有相关文献报道。本研究采用平板对峙法、生长速率法及平板对扣法等对分离到的钩状木霉拮抗效果进行测定。在对峙培养下，观察到钩状木霉菌的生长速度远快于辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌，木霉菌菌丝很快侵入病原菌菌落，使病原菌菌丝体松散、面积萎缩等，特别是对薏苡黑粉菌的效果明显，抑制率高达74.01%。采用生长速率法进一步研究钩状木霉菌液的抑菌效果，结果显示，2、4和6 mL钩状木霉菌液对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌均具有抑制作用，当加入6 mL菌液时对辣椒炭疽菌的抑制率为65.15%，对薏苡黑粉菌的抑制率为85.71%，抑菌效果均较好，说明菌丝的竞争作用可能是钩状木霉抑制植物病原菌的机制之一。另外，本研究在开展钩状木霉无菌发酵液抑菌活性测定时发现，其对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制率均呈先升高后下降趋势，张晓梦等（2020）研究绿色木霉无菌发酵液抗茄子菌核病菌时也出现抑菌率先升高后下降的现象，说明木霉菌无菌发酵液中小分子代谢产物的活性并非随培养时间增加而增强。挥发性物质是木霉菌的主要代谢产物之一，本研究钩状木霉挥发性物质对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制作用测定结果表明，钩状木霉挥发性物质对薏苡黑粉菌的抑制效果远大于对辣椒炭疽菌的抑制效果，抑制率高达82.95%，说明钩状木霉挥发性物病原菌Pathogen辣椒炭疽菌 C.capsici薏苡黑粉菌 U.coicis辣椒炭疽菌空白C.capsici blank control薏苡黑粉菌空白U.coicis blank control菌落直径（cm）Colony diameter2.850.040.250.095.410.181.470.52抑制率（%）Inhibition rate47.29b82.95a-表 3菌株ZQ202104挥发性物质对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果Table 3Inhibitory effects of volatile components of strainZQ202104 on C.capsici and U.coicis图 6菌株ZQ202104挥发性物质对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌的抑制效果Fig.6Inhibitory effects of volatile components of strain ZQ202104 on C.capsici and U.coicisA：辣椒炭疽菌空白组；B：辣椒炭疽菌给药组；C：薏苡黑粉菌空白组；D：薏苡黑粉菌给药组A：C.capsici blank corrtrol group；B：C.capsici drug administration group；C：U.coicis blank corrtrol group；D：U.coicis drug administration group图 5菌株ZQ202104不同发酵天数无菌发酵液对2种病原菌的抑制效果Fig.5Inhibitory effects of the sterile fermentation solution of strain ZQ202104 for different fermentation days against two pathogensA：辣椒炭疽菌；B：薏苡黑粉菌A：C.capsici；B：U.coicisCK7 d9 d11 d13 d15 d17 d7期2057质对薏苡黑粉菌具有较好的拮抗作用，后续可就钩状木霉挥发性物质成分的组成做进一步研究。木霉的抑菌机制较复杂，往往是多种作用机制相互结合，本研究对分离获得的菌株ZQ202104的菌丝体、无菌发酵液中小分子代谢产物及挥发性物质的抑菌活性测定结果表明，菌株ZQ202104可能是以竞争作用与抗生作用相结合的方式拮抗辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌生长。近年来，对木霉菌的研究与应用虽然得到快速发展，但对木霉菌深层次的抑制机理、代谢产物及菌种改良等还有待进一步研究。木霉菌具有产孢量大的分生孢子和厚垣孢子，但分生孢子田间稳定性不如厚垣孢子，且有研究表明，木霉菌厚垣孢子制剂对黄瓜灰霉病的防治效果强于分生孢子制剂（张晶晶等，2017），因此，后续可将钩状木霉厚垣孢子培养作为研究重点。另外，考虑药物的协同增效，可开展木霉属真菌间原生质体融合研究，如张河庆等（2020）研究哈茨木霉与钩状木霉原生质体融合改良菌种，结果得到1株改良木霉菌T2562，并研究改良菌株与其他化学农药的配合使用技术，结果表明，改良菌株与化学农药同时使用于蔬菜，可减少化学农药的使用量，并提高防治效果，降低农药残留量。由此可见，真菌间原生质体融合研究不仅可以得到新菌株，还能提高对病原菌的防治效果，是后续研究的另一个新方向。4结论从黔西南州药用植物鱼腥草根际土壤分离到的钩状木霉菌菌株ZQ202104对辣椒炭疽菌和薏苡黑粉菌均具有抑制作用，特别是对薏苡黑粉菌的抑制效果明显，无论是菌株ZQ202104的菌丝体、小分子代谢产物还是挥发性物质对薏苡黑粉菌的抑制作用均较好，其生防机制可能是竞争作用与抗生作用相结合。钩状木霉菌菌株ZQ202104具有开发成薏苡黑粉菌抑菌剂的潜力。参考文献：韩秀英，赵卫松，齐永志，王文桥，马志强，张小风.2011.辣椒疫霉对双炔酰菌胺敏感性及对其它杀菌剂的交互抗性J.植物保护学报，38（2）：173-177.Han X Y，Zhao WS，Qi Y Z，Wang W Q，Ma Z Q，Zhang X F.2011.Sensi-tive of Phytophthora capsici to mandipropamid