鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价.pdf
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1、王琪琦,黄忠连,王莉,等.鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价 J.食品工业科技,2023,44(23):238245.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100052WANG Qiqi,HUANG Zhonglian,WANG Li,et al.Characteristic Compounds Identification and Authenticity Evaluation ofHeptapleurumHoneyJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):238245.(inChinesewithEng
2、lishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100052 分析检测 鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价王琪琦1,2,黄忠连3,王莉4,董捷2,林珣2,张根生1,*(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150000;2.中国农业科学院蜜蜂研究所,北京100093;3.广西梧州甜蜜家蜂业有限公司,广西梧州543000;4.江苏鸿祺生物科技有限公司,江苏泰州225300)摘要:为明确鹅掌柴蜂蜜中特征性成分并建立鹅掌柴蜂蜜的真实性评价方法,本研究采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-T
3、OF-MSMS)法对鹅掌柴蜂蜜中特征性成分进行定性定量分析。在鹅掌柴蜂蜜中共鉴定出 5 个成分,分别为 4-(1-环乙醚-3-丁二醇)-3,5,5-三甲基-2-环己烯酮(苦蜜素 B)、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、4-(12-二羟基-3环氧丙烷)-3,5,5-2-环己烯酮(苦蜜素 C)、反,反式脱落酸、顺,反式脱落酸。其中首次在蜂蜜中发现 3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇,并将其定为鹅掌柴蜂蜜的标志性成分。收集 10 个不同产地的鹅掌柴原料蜜,建立鹅掌柴蜂蜜的 HPLC 指纹图谱,结合特征性成分和指纹图谱对市售的 6 个鹅掌柴蜂蜜进行真实性评价,结果表明,其中 3 个品牌为品质较好的鹅掌柴蜂蜜,2
4、 个品牌为鹅掌柴蜂蜜中可能混入其他蜂蜜,1 个品牌中未检测到鹅掌柴蜂蜜的标志性成分,并且色谱图与指纹图谱存在明显差异,推测其不是鹅掌柴蜂蜜。本研究为鹅掌柴蜂蜜真实性评价提供理论参考。关键词:鹅掌柴蜂蜜,特征性成分,指纹图谱,真实性评价本文网刊:中图分类号:S896.1文献标识码:A文章编号:10020306(2023)23023808DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100052CharacteristicCompoundsIdentificationandAuthenticityEvaluationofHeptapleurumHoneyWANGQiqi1,2,
5、HUANGZhonglian3,WANGLi4,DONGJie2,LINXun2,ZHANGGensheng1,*(1.CollegeofFoodEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150000,China;2.InstituteofApiculturalResearch,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100093,China;3.TianmijiaBeeIndustryCo.,Ltd.,Wuzhou543000,China;4.JiangsuHongqiBiotechnologyC
6、o.,Ltd.,Taizhou225300,China)Abstract:Inordertoclarifythecharacteristiccompoundsandestablishtheauthenticityevaluationmethodofheptapleurumhoney,high-performanceliquidchromatographycoupledwithquadrupole-time-of-flighttandemmassspectrometry(HPLC-Q/TOF-MS/MS)wasusedtoqualitativeandquantitativeanalysisofc
7、haracteristiccompoundsinheptapleurumhoney.Fivecompoundswereidentifiedincluding4-(1-cyclodiethylether-3-butanediol)-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexenone(UnedoneB),3,4,5-trimethoxycinnamylalcohol,4-(12-dihydroxy-3epoxypropane)-3,5,5-2-cyclohexenone(UnedoneC),trans,transabscisicacid,andcis,transabscisicacid
8、.Notably,3,4,5-trimethoxycinnamylalcoholwasfirstfoundinhoney,anditcouldbeamarkerofheptapleurumhoney.Moreover,10rawheptapleurumhoneysampleswithdifferentgeographicoriginswerecollectedtoestablishHPLCfingerprint.Theauthenticityofsixcommercialheptapleurumhoneysampleswereevaluatedby收稿日期:20221009基金项目:中国农业科
9、学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-2015IAR);国家蜂产业技术体系项目(CARS-44-KXJ19)。作者简介:王琪琦(1998),女,硕士研究生,研究方向:功能食品与生物活性物质,E-mail:。*通信作者:张根生(1964),男,硕士,教授,研究方向:畜产品研究与综合利用,E-mail:。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.2023combiningcharacteristiccompoundwithHPLCfingerprint.Theresultsdemonstrat
10、edthatthreebrandsofsampleweregenuinepureheptapleurumhoney,twobrandsofsamplemightbemixedwithotherhoneys.Abrandsampledidnotcontaincharacteristiccompoundandweresignificantlydifferentwiththestandardfingerprintsofheptapleurumhoney.Itwasinfe-rredthatthesamplewasnotheptapleurumhoney.Thisstudyprovidestheore
11、ticalreferencefortheauthenticityevaluationofheptapleurumhoney.Keywords:heptapleurumhoney;characteristiccomponent;fingerprints;authenticityevaluation蜂蜜是指蜜蜂采集植物花蜜、植物活体分泌物或在植物活体上吮吸的蜜源昆虫排泄物等生产的天然甜味物质,与其自身分泌的特殊物质结合转化、沉积、脱水、贮藏并留存于蜂巢中直至成熟的一种物质1。蜂蜜中主要包含葡萄糖和果糖,此外还含有少量蛋白质、酶、多酚、萜烯类等营养物质24。这些成分赋予了蜂蜜多种功能活性5,如抗菌6
12、、抗炎7、抗氧化8等。鹅掌柴蜂蜜呈浅琥珀色,味甘略带有苦味9,主产自广西、广东等地,是我国南方特有的冬季蜜种。以往关于鹅掌柴蜂蜜的研究只有其抗氧化活性10,而其特征性成分和真实性评价方法的研究几乎没有。据统计,蜂蜜是目前十大最易掺假食品之一11,其掺假方式主要包括向蜂蜜中掺入糖浆1213和向高价蜂蜜中掺入低价蜂蜜。传统的蜂蜜真实性检测方法多集中在孢粉学和糖浆标志物检测上14。然而,孢粉学检测需要专业孢粉学背景,且无法检测多种蜂蜜混合的掺假15。糖浆标志物检测缺点是糖浆的种类繁多,不同种类糖浆的标志物不同,特别是有些糖浆通过大孔树脂等过滤可以有效的去除糖浆标志物,这给蜂蜜的真实性检测带来了巨大困
13、难。AOAC 碳同位素检测也只能检测到 C4 植物糖浆掺假,对 C3 植物糖浆无效1617。核磁共振法和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法价格昂贵,且核磁共振需要大量的真蜂蜜样本建立庞大的数据库作为支撑,无法对超出数据库外的样本做出评价1819。近年来,蜂蜜的真实性检测从对糖浆标志物检测转移到蜂蜜本身化合物检测上。Qiao 等20通过对洋槐蜜、椴树蜜、油菜蜜中的特征性成分的研究,发现洋槐蜜中的萜烯类化合物红花菜豆酸、椴树蜜中的萜烯类化合物椴树素、油菜蜜中的酚酸酯类成分丁香酸甲酯可以作为这三种单花蜜的标志性成分,结合标志性成分和指纹图谱,实现这三种单花蜂蜜的真实性评价。林珣等21对枸杞蜜中植物
14、化合物分析,发现其中特有的黄酮类成分花旗松素,并将其作为枸杞蜜的标志性成分,以此建立枸杞蜜的真实性评价方法。因此,通过挖掘单花蜜中特征性化合物,通过特征性化合物建立单花蜜的真实性评价方法对单花蜜真实性评价具有重要意义。目前针对鹅掌柴蜂蜜品质评价缺乏系统的方法,因此,本研究通过对鹅掌柴蜂蜜中特征性成分进行分析,挖掘鹅掌柴蜂蜜中的特征性化合物,通过特征性化合物和指纹图谱建立鹅掌柴蜂蜜真实性评价方法,为鹅掌柴蜂蜜的真实性评价提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器鹅掌柴蜂蜜样品中国农业科学院蜜蜂研究所提供,采自广东、广西、海南等地;甲醇(色谱纯)、乙酸(质谱纯)美国 ThermoFisher 公司
15、;反,反脱落酸、顺,反脱落酸纯度98%,美国 Sigma 公司;4-(1-环乙醚-3-丁二醇)-3,5,5-三甲基-2-环己烯酮上海源叶生物科技有限公司;3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇纯度97%,本实验室合成。SevenEasyS20 型 pH 计瑞士梅特勒公司;Ther-moSorvall 离心机美国 ThermoFisher 公司;Strata-X-A 固相萃取柱(3mL)美国 Phenomenex 公司;0.22m 滤膜Milipore 公司;安捷伦 6500 型 Q-TOF 液质联用仪,配备 Phenomenex Gemini C18(150mm4.6mm,3m)反相色谱柱美国 Agil
16、ent 公司;DN-24W 氮吹仪上海达洛科学仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1蜂蜜中化合物富集参考乔江涛22的研究方法,称取 20g 蜂蜜样品,加入 80mL 超纯水,制备体积分数为 5%的氨水,将蜂蜜样品 pH 调为 7,放入离心机 9000r/min 离心 15min。保留上清液,合并至烧杯,用 3mL 分析级甲醇活化 SPE 固相萃取柱,再用 3mL 超纯水进行平衡,用固相萃取柱进行富集,结束后用 2mL 超纯水清洗,再用 2mL10%的甲酸甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干后,加入2mL 色谱级甲醇复溶,0.22m 滤膜过滤,装至棕色进样瓶中于 4 下保存,用于分析。1.2.2
17、色谱分析条件流动相 A:0.2%乙酸的纯水,流动相 B:0.2%乙酸的甲醇,柱温箱温度 35、反相色谱柱(C18)、样品进样量 20L、鹅掌柴蜂蜜的检测波长 270nm、总流速 0.7mL/min。鹅掌柴蜂蜜的梯度洗脱方法:010min,9%14%B;1018min,14%15%B;1828min,15%17%B;2840min,1726%B;4044min,2633%B;4454min,3334%B;5464min,3435%B;6469min,3537%B;6974min,3738%B;7484min,3841%B;8489min,4144%B;8996min,4454%B;96126mi
18、n,5465%B;126135min,6580%B。1.2.3质谱分析条件电喷雾 ESI 离子源,出口电压为 125V、喷射电压为 4kV、加热温度 350、氮气(N2)流速为 12L/min、雾化气流速为 80kPa、雾化第44卷第23期王琪琦,等:鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价239器压力 40psi、碰撞气体为氦气、扫描范围为 100900Da23。1.2.4特征性成分定性分析首先通过一级质谱信息确定化合物的分子量及化学式,通过二级质谱数据与数据库比对,并通过二级质谱碎片信息得到化合物大致化学结构,结合化合物的极性、最大紫外吸收,推测出化合物结构。通过购买商业标准品进行验证。1.
19、2.5特征性成分定量分析称取一定质量的苦蜜素 B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、反,反式脱落酸、顺,反脱落酸,配制成 10ml 标准品储备液,按照梯度进样方法进行 HPLC 分析,根据不同的上样量和不同的峰面积建立标准曲线;其中 x 为标准品的上样量(ng),y 为峰面积,如表 1 所示。由于苦蜜素 C 无商业标准品,但苦蜜素 C 和苦蜜素 B 是同分异构体,具有相同的分子量、相同的最大紫外吸收,并且其化学结构也相似。因此苦蜜素 C 含量以苦蜜素 B 的标准曲线来定量。表1标准品的相关信息Table1Informationofstandards标准物质回归方程R2苦蜜素By=1487x5562
20、30.99933,4,5-三甲氧基苯丙烯醇y=1869.6x976640.9996苦蜜素Cy=1487x556230.9993反,反式脱落酸y=2795.2x4664130.9999顺,反式脱落酸y=4513x+1350490.99991.2.6HPLC 指纹图谱的建立将鹅掌柴原料蜜样品的高效液相色谱图,通过中药色谱指纹图谱软件进行相似度分析,在此过程中对比并记录各个样品中的色谱峰相似度,并在允许范围内进行多点校正,即可得到鹅掌柴蜂蜜的标准指纹图谱。1.2.7真实性评价方法a.按照 1.2.1 方法对蜂蜜中的特征性化合物进行富集,在 1.2.2 的色谱条件下得到样品色谱峰。b.将样品色谱峰与标
21、准指纹图谱比对,差异较大或有明显异常色谱峰的样品均不是鹅掌柴蜂蜜。c.色谱图与标准指纹图谱较一致的样品再对其中的特征性成分进行定量分析。d.样品中鹅掌柴蜂蜜的标志性成分 3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的含量应大于或等于原料蜜中最低限量,可判定其为真正的鹅掌柴蜂蜜。1.3数据处理实验所有数据分析基于 SPASS26.0 软件计算平均值及标准偏差,MassHunter10.0 分析质谱数据,ChemBioDrawUltra10.4 绘制化合物结构式,使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件建立鹅掌柴蜂蜜的指纹图谱并且分析其相似度。每组实验均为 3 次平行。2结果与分析2.1鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定鹅掌柴
22、蜂蜜样品的高效液相色谱图如图 1 所示。7006005004003002001000mAU25.050.075.0100.0125.0时间(min)12345图1鹅掌柴蜂蜜样品的 HPLC 图谱Fig.1Chromatogramsofheptapleurumhoney注:1:化合物 1,2:化合物 2,3:化合物 3,4:化合物 4,5:化合物 5。根据化合物的保留时间、最大紫外吸收波长、二级质谱碎片信息,标准品验证分析,确定出鹅掌柴蜂蜜中的 5 个特征性成分。表 2 为鹅掌柴蜂蜜样品的成分鉴定结果。化合物1 在正离子模式下有m/z241.1424M+H+、m/z263.1248M+Na+、m
23、/z481.27852M+H+的准分子离子峰(图 2),负离子模式下有 m/z239.1276M-H的准分子离子峰,因此判断该化合物的分子量为 240。根据其精确质量可计算出化学组成为C13H20O4。由 m/z241.1439M+H+脱水产生碎片离子 m/z223.1308M+H-H2O+,说明化合物含有羟基;由 m/z 241.1439 M+H+到 m/z 197.1171M+H-CH3CHO+,说明化合物含有“CH(OH)CH3”片段;由 m/z137.0956 到 m/z109.1014 是脱 CO,说明化合物结构具有羰基,由 m/z179.1171 到 m/z123.0805,分析结
24、构为环烯,脱去 2-甲基丙烯。该化合物在245nm 处有最大紫外吸收峰,结合相关文献报道初步判定化合物 1 是 4-(1-环乙醚-3-丁二醇)-3,5,5-2-环己烯酮24。后通过标准品对其进行验证,明确化合物 1是 4-(1-环乙醚-3-丁二醇)-3,5,5-2-环己烯酮。表2鹅掌柴蜂蜜样品中化合物信息Table2Compositioninformationonheptapleurumhoney化合物成分时间(min)max(nm)MwMSMSM+H+M-H1苦蜜素B30.21245240109.1014,137.0958,179.1084241.1424239.127623,4,5-三甲氧
25、基苯丙烯醇48.00268224121.1005,151.1104,181.1218225.14763苦蜜素C73.23243240109.1004,137.0952,179.1053241.1444239.05234反,反式脱落酸74.82263264121.0633,135.0796,163.0744265.1417263.12925顺,反式脱落酸84.21263264122.0367,153.0921,189.0922265.1417263.1285240食品工业科技2023 年12月研究表明,环烯醚萜类物质往往带有苦味25,通过VirtualTaste 软件26对化合物 1 苦味度进行
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