仿刺参C1q基因的克隆与表达分析.pdf
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1、D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 2 0 6 2第4 2卷第6期2 0 2 3年1 1月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.6N o v.2 0 2 3仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析陈 仲(辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产动物种质改良与优良苗种繁育重点实验室,辽宁 大连1 1 6 0 2 3)摘 要:C 1 q作为补体经典激活途径的识别蛋白,对于机体的免疫作用至关重要。为探明C 1 q基因在仿刺参免疫防御中的作用,利用构建的仿刺参c D NA文库,通过R A C
2、 E技术克隆得到仿刺参C 1 q(A j C 1 q)的全长c D NA,其序列全长为1 7 1 7b p,其中5 -端非翻译区为1 1 0b p,3 -端非翻译区为6 9 8b p,开放阅读框为9 0 9b p,编码3 0 2个氨基酸。A j C 1 q蛋白具有球状C 1 q结构域,为三聚体,与自然界中大多数动物中的C 1 q结构域有着较高的同源性。实时荧光定量P C R检测结果显示:在仿刺参从受精卵到幼参的发育过程中,A j C 1 q基因的mR NA均有表达,并且在樽形期的表达水平明显增加,到五触手幼体期达到峰值,表明补体系统可能在樽形期被广泛激活;A j C 1 q基因的mR NA在不
3、同组织中均有表达,其中在管足中的表达水平较高;不同病原菌刺激后,A j C 1 q基因的转录表达均在较短时间内发生上调,表明在病原菌刺激下A j C 1 q基因能够快速表达。A j C 1 q可能在仿刺参发育过程中以及免疫应答中起着重要作用。关键词:仿刺参;C 1 q;c D NA克隆;生物信息学中图分类号:Q 7 8文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 6-0 9 3 3-1 2收稿日期:2 0 2 2-0 7-0 6;修回日期:2 0 2 2-0 9-0 2.基金项目:辽宁省百千万人才工程资助项目(2 0 2 1 9 2 1 0 7 1);辽宁省农业科
4、学院基本科研业务费计划项目(2 0 2 2 X T C X 0 5 0 4);辽宁省农业科学院学科建设计划项目(2 0 2 2 D D 2 6 8 1 4 3);大连市重点领域创新团队支持计划项目(2 0 2 1 R T 0 8).作者简介:陈仲(1 9 8 0),男,高级工程师;研究方向:养殖生物免疫及病害.E-m a i l:9 0 3 0 3 5 7q q.c o m.仿刺参(A p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s)为无脊椎动物,属棘皮动物门海参纲刺参科仿刺参属1,是中国北方沿海广 泛分布的最 具经济价值 的动物之一2-3。近年来,养殖规模扩大、
5、养殖密度提高、养殖环境恶化和种质退化等问题导致仿刺参病害频发,造成严重损失的同时也制约了仿刺参养殖产业的健康和可持续发展。仿刺参病害的病原主要为革兰氏阴性细菌,目前,抗生素等药物针对这些病原虽然有较好的防治效果,但因其存在生态环境安全和食品安全风险,在仿刺参病害中的应用受到诸多限制。而绿色、高效的仿刺参病害防控技术、手段仍较为匮乏。因此解析仿刺参免疫系统的防御机制,寻找绿色、高效病害防控技术,成为当前仿刺参病害防控基础研究中的重点4-8。免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫(固有免疫)两种9。仿刺参免疫机制以固有免疫为主1 0,这种免疫是与生俱来的,可遗传,能够迅速抵御外来威胁,具有非特异性1
6、 1-1 2。免疫识别是固有免疫反应过程中极为重要的一步,主要依赖于模式识别蛋白1 0。补体是一种模式识别蛋白,是固有免疫的主要组成部分,可直接被多种病原体激活,随之形成多种活性物质,具有杀灭病原体、抗炎、抗感染、维持 机 体 内 环 境 稳 定 和 免 疫 调 节 等 生 物 活性9,1 3。大多数补体成分表现出生物学功能需要进行激活,补体激活有3种途径:经典途径、凝集素途径和替代途径1 2,1 4-1 5。完整的补体系统极其复杂1 6-1 7,其中经典激活途径是依赖于免疫复合物(又称抗原抗体复合物)(I C)激活实现的。C 1 q是补体1(C 1)的目标识别分子,能够启动补体的经典途径1
7、8。大多数C 1 q配体是通过C端球状C 1 q结构域(g C 1 q)识别的1 9-2 1,g C 1 q可以广泛地与自我配体和非自我配体进行结合,参与多种免疫反应2 2-2 3。补体系统是进化过程中较早出现的防御体系,并一直存在于脊椎动物以及部分无脊椎动物中9。目前,C 1 q为补体系统经典途径的目标识别蛋白,并且是固有免疫和特异性免疫之间的主要链接纽带,其功能研究多集中于脊椎动物。尽管C 1 q在无脊椎动物中的防御机制不断被重视,但研究起步较晚还处于初步探索阶段。仿刺参主要依靠固有免疫抵抗各种外源感染,因此作为固有免疫重要组成部分的补体分子的作用尤为重要,对补体经典途径的起始分子C 1
8、q的研究能更深入地了解仿刺参的免疫防御机制。笔者研究的目标基因为仿刺参C 1 q基因,通过克隆、生物学信息和荧光定量P C R等方法分析该基因在仿刺参体内的作用特性,包括功能结构域的预测以及其在不同组织、不同发育阶段和不同病原刺激后的转录水平表达,以期为防治仿刺参的病害发生提供思路,也为进一步探索仿刺参等海洋无脊椎动物C 1 q基因的免疫机制及其重要性提供理论基础。1 材料与方法1.1 试验材料试验用的仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院海水养殖引育种中心,取健康仿刺参,体质量(1 0.12.3)g,于实验室暂养7d,水温1 61 8,p H8.38.5,盐度2 9。用于不同组织取样和病原菌刺激
9、。取健康仿刺参的体壁、肠道、呼吸树、肌肉、体腔细胞和管足6种组织。每5头仿刺参的同一种组织样品混合为1组,设3组平行,用于R NA提取(提取方法见1.2.1);取健康仿刺参不同发育时期(受精卵、囊胚、原肠胚、小耳幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽形幼体、五触手幼体、稚参及幼参)样品。本实验室自“化皮病”仿刺参中分离出3株革兰氏阴性菌和1株革兰氏阳性菌,经1 6 Sr D NA鉴定,分别为灿烂弧菌(V i b r i os p l e n d i d u s)、产黑假交替单胞菌(P s e u d o a l t e r o m o n a sn i g r i f a c i e n s)、波罗的海
10、希瓦氏菌(S h e w a n e l l ab a l t i c a)和蜡样芽孢杆菌(B a c i l l u s c e r e u s)。1.2 试验方法1.2.1 R NA的提取和c D NA的扩增用R N A p r e pp u r eT i s s u eK i t(T I A N G E N)对仿刺参体腔细胞进行总R N A提取。利用P r i m e rP r e m e r5.0设计特异性引物(表1)。使用S MA R T e rR A C E5/3 K i t(T a k a r a)和A d v a n t a g e2P C RK i t(T a k a r a
11、)进行3 和5 末端扩增。第一轮P C R反应程序:9 4预变性3m i n;9 43 0s,7 23m i n,5个循环;9 43 0s,7 03 0s,7 23m i n,5个循环;9 43 0s,6 8 3 0s,7 2 3 m i n,3 0个循环;7 2 延伸1 0m i n;4保存。以第一轮P C R产物为模板进行第二轮P C R反应,反应条件:9 4预变性3m i n;9 43 0s,6 83 0s,7 2 3m i n,3 0个循环;7 2 延伸1 0m i n;4保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。表1 仿刺参C 1 q的R
12、 A C E引物 T a b.1 R A C Ep r i m e r f o rA.j a p o n i c u sC 1 q引物P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e用途F u n c t i o nC 1 q-3 -R A C E-1 PA C G G T G T C T T C C A C T G C C G GA T AAA C G G C3 -R A C EC 1 q-3 -R A C E-2 PC A G G G T G T A C G G G G GAA G C T C C A G GA T GA3 -R A C EC 1 q-5 -R A C E
13、-1 PC C T C T C G G T C C T C T C GA T C C T T G GA G G C C5 -R A C EC 1 q-5 -R A C E-2 PT GA G G G C C A G G G T C T C C T C G T GAA C AA C A5 -R A C EU PM(L o n g)C T AA T A C GA C T C A C T A T AG G G C AA G C A G T G G T A T C AA C G C AGA G T3 和5 -R A C EU PM(S h o r t)C T AA T A C GA C T C A C
14、 T A T A G G G C3 和5 -R A C ENU PAA G C A G T G G T A T C AA C G C A GA G T3 和5 -R A C E1.2.2 病原菌刺激将1.1中描述的4株菌在2 2 1 6 E液体培养基中培养(2 8,1 5 0r/m i n)至对数期后,将菌液于4、5 0 0 0r/m i n(离心半径1 5c m)离心1 5m i n,获得菌泥,用无菌海水将菌泥重悬,并调节菌悬液密度至1.01 08c f u/m L,用于仿刺参体内注射刺激。将健康仿刺参平均分为6组,每组3 5头仿刺参:4个试验组分别注射1 0 0L的病原菌悬液,对照组注射1
15、 0 0L的灭菌海水,空白组不做任何处理。试验过程中不进行投饵。注射4、1 2、2 4、4 8、7 2、9 6h后,分别从各个试验组和对照组中随机取5头仿刺参的体腔细胞(混合样,设3组平行),迅速投入液氮中冷冻,冰箱-8 0保存备用。1.2.3 实时荧光定量P C R(q R T-P C R)首 先 使 用P r i m e S c r i p tTMR T r e a g e n t K i t(T a k a r a)对1.2.1部分每个样品的总R NA进行反转录,然后采用S Y B RP r e m i xE xT a qTMI IK i t(T l iR N a s e HP l u
16、s)(T a k a r a)进行荧光定量,荧光染料为S Y B RTMG r e e nI,试验在A B IP r i s m7 5 0 0实时荧光定量P C R仪(美国应用生物系统公司)上进439水 产 科 学第4 2卷行。仿刺参C 1 q基因引物序列见表2,内参基因为C y t b2 4。反应总体积为2 0L:2 S Y B RP r e m i xE xT a qTMI I(T l iR n a s e HP l u s)1 0L,R O XR e f e r-e n c eD y e I I 0.4L,c D NA模板2L,上、下游引物各0.8L,d H2O6L。反应条件:9 53
17、0s;9 51 0s,5 52 5s,7 22 5s,4 0个循环。采用2-Ct方法计算仿刺参C 1 q基因mR NA相对表达量2 5。表2 仿刺参C 1 q的实时荧光定量P C R引物 T a b.2 q R T-P C Rp r i m e r f o rA.j a p o n i c u sC 1 q引物P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e用途F u n c t i o nC 1 q-FG G T A G T C A T G GAA C T AA C G G Cq R T-P C RC 1 q-RC T C T C G G T C C T C T C GA
18、T C Cq R T-P C RC Y T B-FT GA G C C G C AA C A G TAA T C内参基因C Y T B-RAA G G GAAAA G GAA G T GAAAG内参基因1.2.4 仿刺参C 1 q(A j C 1 q)基因的生 物信息学分析利用在线服务器O R FF i n d e r(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r/)查找A j C 1 q基因的开放阅读框,并进行分析2 5;将A j C 1 q氨基酸序列上传至在线服务器E x P A S y-P r o t P a r a
19、 mt o o l(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)分析分子量、氨基酸残基组成和长度、蛋白理论等电点及分子量等理化性质2 6;分别 利用 在 线 服 务 器S i g n a l p5.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c ep h p?S i g n a l P-5.0)、E x P A S y-P r o t S c a l e t o o l(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g
20、/p r o t s c a l e/)、TMHMM2.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?TMHMM-2.0)和C e l l-P L o c2.0中E u k-m P L o c 2.0(h t t p:/w w w.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/e u k-m u l t i-2/)对该蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区域以及定位等进行预测2 6-2 7。通过S O P MA(h t-t p s:/n p s a-p r a
21、 b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a_s o p m a.h t m l)分析A j C 1 q的二级结构2 8。利用U n i-F o l d(h t t p s:/h e r m i t e.d p.t e c h/,开源地址:h t t p s:/g i t h u b.c o m/d e e p m o d e l i n g/U n i-F o l d)对蛋白进行建模2 9。利用 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心(h t t p s:/www.n c b i.n l
22、m.n i h.g o v/)搜索并挑选其他物种编码的C 1 q氨基酸序列,使用C l u s t a lX软件进行多种序列比对,运用ME GA X中邻接法绘制系统进化树。应用B i o E d i t软件对上述氨基酸保守序列进行多序列比对。1.2.5 数据分析使用每个样 品 的3组 平 行 试 验 结 果 计 算 仿刺参C 1 q基因mR NA相对表达量的平均值及标准差,试验结果采用S P S S2 2.0软件进行统计分析,用独立t检验 方法检验不 同 组 织、不 同 发 育期、不同细菌 刺激时间的 差异,P0.0 5表明差异显著。2 结果与分析2.1 A j C 1 q生物信息学分析A j
23、 C 1 qc D NA序列全长为1 7 1 7b p,其中5 -端非翻译区为1 1 0b p,3 -端非翻译区为6 9 8b p,开放阅读框为9 0 9b p,编码3 0 2个氨基酸。A j C 1 q含有1个信号肽(图1)。2.1.1 理化性质分析A j C 1 q分子式是C1 4 2 9H2 1 8 5N3 9 7O4 3 7S1 4,分子质量为3 2.3 7k u,理论等电点为5.3 7;带正/负电荷的残基总数(A r g+L y s)/(A s p+G l u)分别为3 1和2 0;该蛋白的不稳定性指数为3 3.2 8,预测其为稳定蛋白。A j C 1 q亲水性蛋白(分值0)约占6
24、0.3%(图2),且平均亲水性系数为-0.3 7 5,小于0,推测该蛋白为亲水蛋白。2.1.2 结构分析TMHMM分析结果表明,A j C 1 q存在跨膜区域(图3 a);S i g n a lP5.0预测该蛋白存在信号肽,分割位点存在于2 3号位和2 4号位之间(AKA2 3-N2 4N)(图3 b);结合亚细胞定位分析,该蛋白可能属于胞外蛋白。S O PMA显示该蛋白的二级结构由7.9 5%的-螺旋、4.9 7%的-转 角、6 8.5 4%的 无 规 则 卷 曲 和1 8.5 4%的延伸链所构成(图3 c),其中延伸链可通过氢键的作用形成-片层结构3 0,由通过氢键网络连接的延伸多肽链(-
25、链)组成。539第6期陈 仲:仿刺参C 1 q基因的克隆与表达分析图1 A j C 1 qc D NA序列和预测的氨基酸序列全长F i g.1 T h e s e q u e n c ea n df u l l l e n g t ho fd e d u c e da m i n oa c i d s s e q u e n c e f o rA j C 1 qc D N A信号肽加方框标注;C 1 q家族结构域用灰色背景标注;P o l y A序列加粗标注;六核苷酸多腺苷化信号(a a t a a a)斜体加粗标注.T h es i g n a l p e p t i d e i sm a
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