动物乳汁“人源化”的研究进展.pdf
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1、第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023综述收稿日期:2023-06-07基金项目:全军实验动物专项课题(SYDW202007)作者简介:共同第一作者张睿(1990),女,博士,助理研究员,研究方向:动物遗传育种与实验动物模型创制.E-mail:zhangrui6288 毋云鹏(1998),男,在读硕士生,研究方向:实验动物模型创制.E-mail:wuyunpeng821 通信作者:陈菁青(1990),女,博士,助理研究员,研究方向:动物营养与实验动物模型创制.E-mail:CJQ95
2、12 动物乳汁“人源化”的研究进展张 睿 毋云鹏 武文卿 孙天奇 邱业峰 陈菁青(军事科学院军事医学研究院实验动物中心,北京100071)摘要:动物乳腺生物反应器通过转基因技术将外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺,进而利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力,在动物乳汁中生产具有重要价值的产品,尤其是一些人源化蛋白。这项技术具有成本低、质量高、生物活性高、无污染、产量高等优点,开创了生物制药的新途径,发展前景广阔。本文主要对动物乳汁“人源化”在生物制药领域和改善乳成分方面的研究进展及应用前景进行综述和展望。关键词:乳腺生物反应器;转基因动物;生物制药;改善乳成分中图分类号:Q95-
3、3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0095-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.05.018Research Arogress on“Humanization”of Animal Milk ZHANG Rui,WU Yunpeng,WU Wenqing,SUN Tianqi,QIU Yefeng,CHEN Jingqing(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)Abstract:Animal
4、 mammary gland bioreactors use transgenic technology to introduce exogenous genes into animal genomes and locate and express them in animal mammary glands,and then utilize the ability of animal mammary glands to synthesize and secrete proteins naturally and efficiently to produce some valuable produ
5、cts in animal milk.This technology has the advantages of low cost,high quality,high biological activity,no pollution,and high yield.It has created a new way of biopharmaceuticals and has broad development prospects.In this paper,a brief review and prospect of the application research,technical metho
6、d,future application prospects and challenges of animal milk“humanization”in the field of biopharmaceuticals and improving milk composition are made.Key words:mammary gland bioreactor;transgenic animals;biopharmaceuticals;improving milk composition动物生物反应器是利用转基因技术将外源目的基因导入并整合到活体动物基因组中,使得其组织或器官中可高效表达这
7、种外源蛋白,以实现功能蛋白质工业化生产的技术。按照目的蛋白表达部位的不同,动物生物反应器有蛋清、血液、乳腺、唾液腺、尿液等不同种类1。由于乳腺可以高效表达重组蛋白并且可以进行翻译后修饰2,一般认为乳腺生物反应器是较优的选择,也是目前国际上惟一可以实现商业化的生物反应器1。近年来,随着基因编辑技术的兴起和快速发展,以及人们对高质量生物制品需求的日益增大,大型动物生物反应器平台技术已经日趋成熟,通过转基因技术制备的人源化重组蛋白开始不断涌现。转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)、成簇规律间隔短回文
8、重复序列/相关蛋白 9(clustered regularly interspaced 实验动物科学40 卷short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)等技术已经成功应用于改善乳成分和生产人源化药用蛋白等方面3-5,为动物乳汁“人源化”提供了坚实的基础。与蛋清、血液等其他表达系统相比6,转基因动物乳腺生物反应器具有非常多的优势,如:人源化蛋白表达效率高、生物学活性高、翻译后可修饰、不产生内毒素、生产成本低等。因此,动物乳腺生物反应器是极具发展前景的制药新途径之一。本文主要对动物乳汁“人源化”在生物制药领域和
9、改善乳成分方面的应用研究、以及其未来的应用前景进行综述和展望。1乳腺生物反应器生物反应器最初是指细胞、细胞提取物或酶进行生物反应的地方,现在一般指的是用于生产重组蛋白质的细胞或微生物的生长室。用于生产治疗性蛋白质的转基因动物生物反应器已存在数十年,在这些系统中生产的几种蛋白质现在正在临床试验中,其中有的已被批准用于市场销售。与其他表达系统相比,乳腺是转基因动物生物反应器的优先选择,产生的乳汁易于大量收集有价值的人源化重组蛋白。我国的施履吉院士在 20 世纪 80 年代初就提出了乳腺生物反应器的构想,并组织 6 个单位的科技人员开始实施“哺乳动物个体表达系统的研究”。1987 年,Gordon
10、等5首次报道了在小鼠乳汁表达人组织 纤 溶 酶 原 激 活 素(human tissue plasminogen activator,htPA)。此后,乳腺动物反应器逐渐成为转基因动物研究领域的热点之一,各种人源化的药用蛋白不断在兔、山羊、绵羊、猪和牛等乳腺和其他器官表达和分泌,目前利用转基因牛、山羊、绵羊乳腺反应器生产的人源化重组蛋白有细胞因子、基因工程疫苗、抗体、酶制剂等,如:人凝血酶、人凝血因子、人凝血因子、人乳铁蛋白、人血清白蛋白等4,7-9。20 世纪末,国家“863”计划将乳腺动物反应器归为资助的重大项目,促进了中国动物乳腺生物反应器研究的蓬勃发展。在生产人源化的药用蛋白方面,研究
11、人员5利用 TALEN 技术和体细胞核移植技术,在荷斯坦奶牛的-乳球蛋白位点定点插入了重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)基因,成功获得可以在乳腺特异表达 rHSA 的转基因牛。有研究10利用转基因兔乳腺反应器成功生产出了重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),得到的转基因兔乳汁中 rhGH 的表达量可以达到 10 g/mL。在生产基因工程疫苗、抗体方面,有研究11利用 TALEN 基因打靶技术和体细胞克隆技术将猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV
12、)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)这 3 种病毒具有免疫原性的结构蛋 白 基 因 定 点 整 合 到 山 羊-乳 球 蛋 白(-lactoglobulin,BLG)基因座,并获得了在乳汁中表达重组蛋白的转基因山羊,该重组蛋白可以诱发机体产生特异性体液免疫反应,为利用乳腺生物反应器研制人源化的亚单位疫苗奠定了基础。有研究12利用 Cre/loxp 重组酶系统将人表皮生长因子受体 2(human epider
13、mal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2)抗体基因成功定点整合到人溶菌酶转基因山羊细胞内,成功制备了乳腺特异表达 Her2 抗体蛋白的人溶菌酶转基因山羊。有研究13选择兔-酪蛋白(casein beta,CSN2)基因座作为整合 VP6 基因的靶位点设计了一种适用于基于乳腺生产轮状病毒疫苗的方案,为生产轮状病毒亚单位疫苗提供了一种新策略,并为建立更广泛的基于乳腺生物反应器生产的疫苗奠定了基础。在细胞因子方面,有研究9利用体细胞核移植技术 生 产 了 可 以 在 乳 汁 中 表 达 人 凝 血 因 子(human coagulation factor IX,
14、hFIX)的转基因山羊。有研究14构建了三代可以表达重组人凝血因子VIII(rhFVIII)的转基因兔,rhFVIII 在几代转基因兔乳汁中均可表达,且乳汁中分泌 rhFVIII 蛋白的生物活性范围在 0.012 0.599 IU/mL,相当于正常人血浆中 hFVIII 水平的 1.2%59.9%。在生产酶制剂方面,美国 GTC Biotherapeutics公司成功在转基因山羊乳汁中获得重组人凝血酶(Atryn),并且通过了 III 期临床试验,于 2006 年获得欧洲药品管理局批准上市,于 2009 年获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准认证,证明了利用转基因动物乳腺生产重组蛋白的实
15、用性,极大的促进了这一领域的科学研究和商业应用11。有研究15利用克隆技术成功制备出可以在乳汁中特异性表达重组人溶菌酶(recombinant human lysozyme,69第 5 期张睿等:动物乳汁“人源化”的研究进展 rhLZ)的转基因猪,在 F0 代母猪乳汁中具有体外生物活性的 rhLZ 最高浓度达(2 759.6265.0)mg/L。有研究16通过体细胞核移植技术成功制备可以在乳汁中 特 异 性 表 达 人 超 氧 化 物 歧 化 酶 1(human superoxide dismutase 1,hSOD1)和人超氧化物歧化酶3(human superoxide dismutase
16、 3,hSOD3)的转基因山羊,在转基因羊乳汁中检测到 rhSOD1 和 rhSOD3 的浓度 分 别 为:(88.81 8.36)mg/L 和(267.82 12.67)mg/L。2007 年,美国一家专门从事生化防御药物开发的公司(Nexia/PharmAthene)研制出一批表达 重 组 人 丁 酰 胆 碱 酯 酶(recombinant human butyrylcholine esterase,rhBChE)的转基因山羊,其乳汁中产生的 rhBChE 是人血浆中丁酰胆碱酯酶含量的 1 000 多倍17,该 rhBChE 于 2009 年完成 FDA IND 申报和临床 I 期试验,用
17、于神经毒剂的解毒。2乳汁“人源化”的技术方法基因编辑技术是实现乳汁“人源化”的关键。基因编辑技术是对基因组中目标位点进行改造的一种生物技 术,通过精 确地插入、删 除或替换目 标DNA 序列,实现基因干扰、敲入、修复等目的。在真核生物细胞特别是哺乳动物细胞中,基因编辑技术由于其高简便性,在基础科学、生物技术和医药领域方面应用具有巨大潜力18。目前在乳汁“人源化”中应用最多的两个主要平台分别是:TALENs 和 CRISPR/Cas 系统。TALEN 是人工改造的核酸内切酶,来自植物病原体黄单胞菌的 TALE 蛋白具有 DNA 结合特异性,高度保守的 33 35 个氨基酸 TALE 重复序列各自
18、结合单个碱基对 DNA 19,这些模块化 TALE 重复序列可以链接在一起,构建具有自定义 DNA 结合特异性的长阵列20。目前,该技术已经成功运用在了利用乳腺反应器生产人源化重组蛋白5,21、基因工程疫苗11等方面。自 2013 年 CRISPR/Cas9 技术成功应用于哺乳动物的基因组编辑之后,利用 CRISPR/Cas9 系统介导乳汁“人源化”的研究便成为乳腺生物反应器研究领域的一大热门。2017 年,有研究使用 CRISPR/Cas9 系统靶向山羊成纤维细胞中的-乳球蛋白(BLG)基因座进行 BLG 基因的敲除,改造羊乳成分,从而获得无 BLG 表达的山羊,为山羊乳汁“人源化”提供了科
19、学依据3。3乳汁“人源化”的应用前景多年来,已有数种高价值的产品在大动物乳汁中生产出来,从国际大公司开发的情况可以看出,高经济价值的医用蛋白和营养蛋白是乳腺生物反应器重要的研发对象,乳腺生物反应器制药无疑是具有前瞻性和革命性的新一代的制药模式。除此之外,在使得乳汁或乳制品更有利于人类健康方面,敲除乳汁中的过敏原基因从而改变乳汁中的原有成分,或者表达一些外源营养蛋白来提高乳汁本身的营养价值,都是极具潜力的发展方向。在生产医用蛋白和营养蛋白等制药方面,全球众多开展动物乳腺生物反应器的产业化开发的公司中,美国最大的生物技术公司 Genzyme Transgenics Corporation(GTC)
20、、英国 PPL Therapeutics(PPL)公司和荷兰 Pharming 是 3 个出色的以乳腺生物反应器为核心技术的公司。其中,GTC 公司率先在羊奶中生产抗凝血药 ATryn 是世界第一个上市的由乳腺生 物 反 应 器 生 产 的 孤 儿 药。2009 年 Nexia/PharmAthene 公 司 研 制 的 羊 奶 产 rhBChE 已 完 成FDA IND 申报和临床 I 期试验,用于神经毒剂的解毒17。2010 年荷兰 Pharming 公司兔奶产遗传性血管水肿治疗孤儿药 Ruconest 获欧盟批准上市,2014年获 FDA 批准在美国上市,目前正与上海医工院合作将该药的生
21、产报批引入中国。因此,利用动物乳腺生物反应器生产医用和营养药品具有巨大的市场潜力。在改良乳品质方面,随着近年来生活水平的不断提高,人们对乳品质的食用要求也越来越高。不论是牛乳,还是在国际营养界被称为“奶中之王”牛乳过敏症患者较理想的替代乳品的羊乳22,都存在BLG 等过敏原,会引起人体过敏反应,且其致敏性无法通过加热、酶水解和糖基化等处理消除,反而会加重过敏反应23。因此,消除乳中致敏成分的同时增加功能营养蛋白成分,使其更适合于人类饮用,无疑是提高乳品质的一个重要研究方向。2015 年,西北农林科技大学张涌院士团队通过 TALEN 诱导山羊同源重组生产了不含 BLG 的高人乳铁蛋白奶4;201
22、6 年,该团队又利用 TALEN 技术生产了可以在乳腺中表达人血清白蛋白的基因编辑牛5。2018年,中国农业大学生物学院戴蕴平团队利用 ZFN 技术敲除 BLG 基因产生无 BLG 牛奶,从而改善人对79 实验动物科学40 卷BLG 产生过敏反应的乳糖不耐症,具有极大的应用价值24。因此,利用新技术实现对大型动物基因组的精准编辑,按需改造和提高乳品质,也是未来乳腺生物反应器的发展方向。4面临的挑战转基因动物乳腺生物反应器自出现后经历了辉煌的发展阶段,如今更是创造了一个新的现代生物医药产业。虽然其拥有广阔的发展潜力和前景,但在理论和技术方面还存在问题需要不断的解决和改进。一是转基因动物构建的成功
23、率。由于细胞中同源重组(homologous recombination,HR)的效率很低,DNA 大片段的敲入受到技术方面的限制,细胞中 DNA 片段的敲入效率在很大程度上取决于多种因素,例如 HR 臂的大小、转染方法、标记选择和靶基因位点等。有人建议通过调节细胞周期25或非同源末端链接(non-homologous end joining,NHEJ)和 HR 途径26-27来提高敲入效率。此外,添加各种细胞 因 子 也 可 以 提 高 敲 入 效 率,如:SCR7 吡 嗪(NHEJ 抑 制 剂)处 理 细 胞 会 降 低 NHEJ 并 增 强 HR27,RAD51 重组酶(RAD51)过表
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