党参多糖对脑缺血再灌注损伤大鼠血清S100-β及NSE水平的影响.pdf
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1、第 40 卷第 5 期2023 年 10 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.5October 2023论著收稿日期:2023-03-06基金项目:高气压致轻度认知功能障碍的机制(20AH0301)作者简介:刘飞(1992),男,硕士研究生,研究方向:人类疾病动物模型研究.E-mail:648222872 通信作者:唐瑛(1964),女,教授,研究方向:人类疾病动物模型研究.E-mail:maotou01 党参多糖对脑缺血再灌注损伤大鼠血清 S100-及NSE 水平的影响刘 飞 邹赢锌 焦 勇 唐 瑛(海军军医大学海军特色医学中心,上海200433
2、)摘要:目的观察党参多糖对缺血再灌注损伤大鼠血清 S100-蛋白(S100-)及神经特异性烯醇化酶(NSE)含量的影响。方法随机将 SD 大鼠分成 5 组:假手术组、模型组、依达拉奉组和 2 个党参多糖高、低剂量组,每组 10只。采用线栓法阻断大鼠中脑闭塞(MCAO)2 h 后再灌注 24 h 建立脑缺血再灌注模型,2 个党参多糖和依达拉奉组大鼠术前连续 14 d 给予相对应的药物,于再灌注后 24 h 取样,采用尼氏染色和 HE 染色法进行组织学观察,测量脑含水量及伊文思蓝法以评估卒中,ELISA 法分别检测各组血清中 NSE 和 S100-水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠脑组织含水量及
3、通透性明显增加(P0.01),血清中 NSE 及 S100-蛋白含量明显增加(P0.01)。与模型组相比较,党参多糖高、低 2 个剂量组血清中 NSE 和 S100-蛋白含量明显降低(P0.01),且党参多糖高剂量组脑组织含水量及通透性明显降低(P0.01)。结论党参多糖能明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的程度,降低血清中 NSE 和 S100-水平,具有良好的神经保护作用。关键词:党参多糖;脑缺血再灌注;S100-蛋白;神经元特异性烯醇化酶;大鼠中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)05-0053-07DOI:10.3969/j.issn.1006-6179
4、.2023.05.010Effects of Codonopsis Pilosula Polysaccharide on Serum S100-and NSELevels in Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion InjuryLIU FeiZOU YingxinJIAO YongTANG Ying(Naval Characteristic Medical Center,Naval Medical University,Shanghai 200433,China)Abstract:ObjectiveTo observe Codonopsis pilos
5、ula polysaccharide(CPPS)on ischemia-reperfusion injury of rat serum S100-protein and neuron-specific enolase(NSE)levels.MethodSD rats were randomly divided into 5 groups,namely sham operation group,model group,Edaravone group and 2 codonopsis pilosula polysaccharide(CPPS)high-dose and low-dose group
6、s,with 10 rats in each group.By using line switch block rat middle cerebral artery occlusion(MCAO)2 h reperfusion 24 h after cerebral ischemia reperfusion model is set up,two CPPS and edaravone group rats were given corresponding drugs for 14 consecutive days before surgery,Nissl staining and HE wer
7、e used for histological observation 24 h after reperfusion.Cerebral water content was measured and Evans blue method was used to assess cerebral apoplexy.Serum NSE and S100-levels were determined by ELISA.ResultCompared with sham operation group,the water content and permeability of brain tissue in
8、model group were significantly increased(P0.01),and the contents of NSE and S100-protein in 实验动物科学40 卷serum were significantly increased(P 0.01).Compared with model group,serum NSE and S100-protein contents in CPPS high-dose and low-dose groups were significantly decreased(P0.01),and brain tissue wa
9、ter content and permeability in CPPS high-dose group were significantly decreased(P0.01).ConclusionCPPS can significantly reduce the level of NSE and S100-in serum of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,and have good neuroprotective effect.Key words:codonopsis pilosula polysaccharide(CPPS
10、);cerebral ischemia/reperfusion;S100-protein;neuron specific enolase(NSE);rats卒中危害公共健康,具有高死亡率和致残率的特点1。脑缺血被认为是全球范围内的主要死亡原因。该病的预后高度依赖于早期医疗干预2。国内外学者发现血液生物标志物的循环水平与神经组织损伤相关,不仅可用于缺血性卒中尤其是早期阶段(发病后 72 h 内)诊断,还可用于缺血性卒中的严重程度评估及监测梗死进展,甚至有助于早期成像结果呈阴性的有症状患者的诊断3-4。脑缺血后神经元受损、胶质细胞坏死及血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的损
11、伤致使 S100-蛋白及神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)释放进入血液,其血清中水平的变化能够反映脑损伤程度及疾病的预后5。因此,本研究通过党参多糖(codonopsis pilosula polysaccharide,CPPS)预处理后建立大鼠中脑闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,研究缺血再灌注损伤大鼠血清中 S100-蛋白和 NSE 水平的变化,探讨 CPPS 对脑缺血再灌注损伤的保护作用,为临床提供实验依据。1材料和方法1.1材料1.1.1动物分组与给药:SPF 级 雄性 SD 大鼠 130只
12、,体质量(28020)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,生产许可证号【SCXK(沪):2018-0016】。动物饲养于海军特色医学中心动物房,许可证号【SYXK(沪)2022-0033】。饲养条件:室 温1224 ,采用 12 h/12 h 昼夜间断照明,分笼饲养,自由饮水。动物购进后在本单位动物房饲养 1周后,随机分为假手术组(Sham)、模型组、依达拉奉组 10 mg/(kgbw)、CPPS 低【1 g/(kgbw)】、高【2 g/(kg bw)】两个剂量组,每组 10 只。术前 2 个CPPS 组按实验设计每天灌胃 1 次,连续给药 14 d,给药体积为 1 mL/100 g;依
13、达拉奉组按 10 mg/(kgbw)每日尾静脉注射 1 次,连续给药 14 d;其余两组给予等体积的双蒸水。本实验分 3 批次完成。所有实验均经过海军特色医学中心动物伦理委员会授权(NMC-2021041),整个实验期间按照实验动物的护理和使用指南进行操作。1.1.2药品:党参多糖(CPPS),黄褐色粉末状,纯度 32.8%,购自西安天一生物科技有限公司;依达拉奉注射液(规格 20 mL 30 mg,国药集团国瑞药业有限公司)。1.1.3试剂与仪器:MCAO 栓线(北京沙东生物技术有限公司);神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S100-蛋白 ELASA 检测试剂盒(上海研谨生物科技有限公 司);
14、伊 文 思 蓝(evans blue,EB)(MP Bio medicals,LCC);其余试剂均为国产分析纯。752N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。1.2方法1.2.1动物模型制备及处理:各组大鼠末次给药1 h 后,采用改良 Longa 线栓法6,腹腔注射 1%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g)麻醉,取仰卧位,钝性分离出右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。结扎颈总动脉近心端,用动脉夹暂时夹闭颈内、外动脉分叉处,将栓线通过颈总动脉小切口插入,打开动脉夹,插入深度约为 18 mm,栓线入颅至大脑前动脉,以阻断大脑中动脉所有血流来源,缝合伤口。2 h 后轻轻取线恢复血流。假手
15、术组进行了相同的手术,但不插入栓线。在手术过程中始终维持大鼠体温和保持适宜环境温度。1.2.2神经功能评分:参考经典 Zea Longa6评分标准进行神经行为学评分。按照 5 分制评分原则(0 分:无神经功能受损体征,活动正常;1 分:不能完全伸展对侧前爪;2 分:行走时向对侧转圈;3 分:向对侧倾倒;4 分:不能自发行走,意识丧失)对缺血再灌注 24 h 后的大鼠进行神经功能缺失评分。得分在 24 分,说明造模成功。45第 5 期刘飞等:党参多糖对脑缺血再灌注损伤大鼠血清 S100-及 NSE 水平的影响 1.2.3脑含水量测定:实验结束后每组各 10 只,于再灌 注 24 h 后,采 用
16、1%戊 巴 比 妥 钠【0.3 mL/(100 g bw)】腹腔麻醉安乐后取脑,在冰盒上迅速分离右侧脑组织并称重(湿重)。再将右侧脑组织在干燥箱 110 烘干 24 h 至恒重(干重)。按下式公式计算:脑组 织 含 水 量(%)=(湿 重-干 重)/湿重100%1.2.4血脑屏障通透性的检测:采用伊文思蓝染料(EB)法测定 BBB 的通透性。实验结束后每组各 10只大鼠,于再灌注 23 h 后经尾静脉注射 2%伊文思蓝【4 mL/(kgbw)】,注射 2 h 后,采用 1%戊巴比妥钠麻醉后,打开大鼠胸腔,从左心室插入注射针头,于右心耳部剪一小口,向内注入 0.9%氯化钠溶液,直至右心耳流出液体
17、变清亮,表明已将残存于血管内生物 EB 充分排出,然后开颅取脑,沿正中线称取脑损伤部位约 100 mg 脑组织,将其浸泡在 3 mL甲酰 胺 中,50 水 浴 72 h,1 500 r/min 离 心10 min,取上清液。用分光光度计(=630 nm),测定上清液 A 值,计算每克脑组织中 EB 的含量(g/g脑组织)。1.2.5血清中 NSE 及 S100-蛋白含量检测:实验结束后,将大鼠麻醉后腹主动脉取血,离心取上清,-80 下 冻 存 备 用。按 照 试 剂 盒 说 明 书,采 用ELASA 法检测血清中 NSE 及 S100-蛋白。1.2.6HE 染色:给药及建模同上,每组 5 只大
18、鼠。再灌注 24 h 后,将麻醉后大鼠用 4%多聚甲醛进行心脑灌注,然后取脑组织,将脑组织放入 10%多聚甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋切片。将组织切片脱蜡,苏木精染色,伊红复染,水洗,脱水,透明,封片。光镜下观察拍照。1.2.7尼氏小体染色:将组织切片用甲酚紫溶液56 染色 60 min,蒸馏水洗涤 2 次,95%乙醇分化 2次,每次 2 min;切片在 100%乙醇中脱水 5 min,在二甲苯中清除 5 min。封片,在光镜下观察 Nissal 染色的细胞。正常神经元细胞内含丰富的细胞质和大的细胞体,伴有大量尼氏小体。而细胞受损时胞体萎缩,细胞核浓缩,尼氏小体减少或缺失。1.3统计学分析采用
19、 SPSS 20.0 统计软件。实验数据以均数标准差(xs)表示,组间比较采用 t 检验。2结果 2.1CPPS 对 MCAO 诱导的缺血大鼠的影响大鼠建立脑 MCAO 模型后进行神经功能缺损评分。假手术组无神经功能缺失,评分为 0 分。与假手术组相比,模型组大鼠神经功能学评分增加(3.200.79,P0.01),提示严重功能障碍(表 1)。与模型组相比,依达拉奉组大鼠神经功能评分明显降低(2.20 0.79,P 0.05),具 有 统 计 学 意 义。CPPS 高剂量组明显降低,具有统计学意义(2.200.79,P0.05),CPPS 低剂量组神经功能评分也降低但无统计学意义(2.500.8
20、5)。表 1大鼠神经功能评分Table 1Neurological function scores of rats组别神经功能评分假手术组0模型组3.200.79#依达拉奉组2.200.79CPPS 高剂量组2.200.79CPPS 低剂量组2.500.85注:与假手术组比较,#P0.01;与模型组比较,P0.05。Note:Compared with the namely sham operation group,#P 0.01;Compared with the model group,P0.05.同样,与假手术组相比,模型组大鼠脑含水量增加(79.17%0.35%,P0.01)。与模型组
21、相比,依达拉奉组大鼠脑含水量明显降低(76.95%0.67%,P0.01)。CPPS 高剂量组脑含水量明显降低,具有统计学意义(77.22%0.51%,P0.01),CPPS 低剂量组脑组织含水量降低但无统计学意义(79.07%0.67%)(图 1)。2.2CPPS 对缺血再灌注大鼠 BBB 通透性的影响与假手术组相比,模型组大鼠脑组织 EB 含量增加(302.8535.77,P0.01)。与模型组相比,依达拉奉组大鼠脑组织 EB 含量明显降低(249.9360.28,P0.05)。CPPS 高剂量组脑组织 EB 含量明显降 低,具 有 统 计 学 意 义(233.58 39.50,P 0.0
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