丹参与滇丹参正交后代育性鉴定及花部形态与生化活性.pdf
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1、2023年36 卷10 期Vol.36No.10引用格式:邹转,田红彦,袁翔宇,贺陆洋,徐绍忠,赵昶灵,陈天凤,殷举娇:丹参与滇丹参正交后代育性鉴定及花部形态与生化活性J西南农业学报,2023,36(10):2151-2157.Zou Z,Tian H Y,Yuan X Y,He L Y,Xu S Z,Zhao C L,Chen T F,Yin J J.Fertility identification and flower morphology and biochemical activity in F,generations between Salvia miltiorrhiza and S
2、alvia yunnanensisJ.Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2023,36(10):2151-2157.DOI:10.16213/ki.scjas.2023.10.010.西南农业学报Southwest China Journal of Agricultural Sciences丹参与滇丹参正交后代育性鉴定及花部形态与生化活性2151邹转,田红彦,袁翔宇,贺陆洋,徐绍忠,赵昶灵,陈天凤,殷举娇(云南农业大学农学与生物技术学院,昆明6 50 2 0 1)摘要:【目的】探索丹参类正交后代不育类型及不育原因,为丹参类药材新种
3、质的研究提供材料。【方法】以丹参与滇丹参正交后代作为试验材料且以亲本作为对照,利用TTC和I2-KI对3种材料进行花粉活力鉴定、花朵形态学观察以及不同发育时期花蕾的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量测定和过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性测定。比较3种材料各指标的变化后分析引起不育的原因。【结果】花粉活力测定表明正交后代花粉粒无活力,判定其为雄性不育;观察不同材料花部特征可知:正交后代花丝长度介于亲本之间但3种材料无显著差异;花药长度3种材料间存在显著差异;正交后代的花瓣上唇长和宽均介于2 个亲本之间,正交后代和滇丹参之间无显著差异;丹参下唇长和
4、宽均大于正交后代及滇丹参。在花的整个发育过程中,丙二醛(MDA)含量正交后代高于丹参与滇丹参;可溶性糖含量正交后代较亲本略有升高;游离脯氨酸含量正交后代呈先上升后下降趋势;SOD活性呈先升高后下降再升高趋势;POD活性正交后代比亲本高。而从单核期到成熟期,可溶性蛋白含量正交后代急剧下降而滇丹参与丹参则依然呈上升趋势;CAT活性正交后代变化不大,2 个亲本略有下降。【结论】丹参与滇丹参正交后代的不育类型为雄性不育,其花部形态均无异常变化。在花的整个发育过程中,由于可溶性糖、可溶性蛋白含量变化,导致正交后代的花营养不足,而脯氨酸含量低导致花药抗逆性差,MDA含量、CAT、SO D 及POD等酶活性
5、异常造成细胞内不能及时清除自由基、活性氧等对细胞膜造成伤害的物质,最终导致正交后代不育。关键词:丹参;滇丹参;正交;花的形态;生理生化;不育中图分类号:S567.5+3Fertility identification and flower morphology and biochemical activityin F,generations between Salvia miltiorrhiza and Salvia yunnanensis文献标识码:A文章编号:10 0 1-48 2 9(2 0 2 3)10-2 151-0 7ZOU Zhuan,TIAN Hong-yan,YUAN Xia
6、ng-yu,HE Lu-yang,XU Shao-zhong,ZHAO Chang-ling,CHEN Tian-feng,YIN Ju-jiao(College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)Abstract:Objective In order to offer resources for the research of fresh Salvia divinorum herb germplasm,the different types of sterilit
7、yand the factors that contributed to sterility in F,generations were investigated.Method In the experiment,the F,generations betweenS.miltiorrhiza and S.yunnanensis were used as experimental materials and their parents as controls:Pollen viability was identified by TTCand I2-KI,flower morphology was
8、 observed,the contents of soluble protein,soluble sugar,proline and malondialdehyde in flower buds weredetermined,and the enzyme activities of catalase(CAT),peroxidase(POD)and superoxide dismutase(SOD)were determined.Aftercomparing the changes of each index of the three materials,the causes of infer
9、tility were analyzed.Result The determination of pollen vigorshowed that the pollen grain of the F,generations had no vitality and it was determined to be male sterile;The observation of the flower char-acteristics of different materials showed that the filament length of the Fi generations was betw
10、een the parents,but there was no significantdifference in the anther length of the three materials;The length and width of the upper lip of the petals of the F,generations were between收稿日期:2 0 2 2-0 7-19基金项目:云南省科技厅重大科技专项(2 0 18 ZF010-1);云南农业大学科研发展基金项目(KX900073000)第一作者:邹转(1996-),女,硕士,研究方向为药用植物资源评价。E-
11、mail:通讯作者:徐绍忠(196 9-),男,副教授,主要从事药用植物研究。E-mail:2152the two parents,and there was no significant difference between the F generations and S.miltiorrhiza.The length and width of lower lip ofS.miltiorrhiza were larger than those of F,generations and S.miltiorrhiza yunnanensis.During the whole process of
12、 flower development,thecontent of MDA in F,generations was higher than that in S.miltiorrhiza yunnanensis.The content of free proline in flowers of F generationsincreased at first and then decreased.The activity of SOD increased at first and then decreased and then increased.The activity of POD wash
13、igher than that of parents.From uninucleate stage to mature stage,the content of soluble protein in flowers of Fi generations decreasedsharply,while the content of soluble sugar in Fi generations increased only slightly compared with their parents;There was no significantchange in CAT activity in fl
14、owers of F,generations.Conclusion The male sterility type ofFi generations was male sterility,and the malesterility had no abnormal change in flower morphology.The change of soluble sugar and soluble protein content resulted in insufficient nutri-tion,low proline content and poor anther stress resis
15、tance.The abnormal activities of MDA,CAT,SOD,POD caused the failure to removefree radicals,reactive oxygen species and other substances that caused damage to the cell membrane in time,resulting in the sterility of Fgenerations.Key words:Salvia miltiorrhiza;Salvia yunnanensis;Forward hybridisation;Fl
16、ower morphology;Physiological biochemistry;Sterility【研究意义】滇丹参(Salvia yunnanensis C.H.Wright)又名云南鼠尾草,为多年生草本植物。与中药丹参同属且药理活性相似2 ,因此往往作为丹参的代替品使用3。丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)始载于神农本草经,因其疗效显著被列为上品4,也是历版中国药典收载中药丹参的唯一基源植物5。近年来,虽然丹参种植面积扩大,但是丹参种质混杂、退化问题增多。长期在种植上形成只种不选和栽培管理方式不合理也使人工栽培丹参的产量和质量严重下降。【前人研究进展】舒志明等6-
17、7 选择3个不育类型的丹参作母本、陕西丹参作父本进行杂交育种。刘竟飞等8 1采用单交育种法对2 个不同的丹参品种进行正反杂交,发现植物花粉粒发育过程中往往会积累营养物质,营养物质的积累为植物花粉粒的生长发育提供能量。朱广廉等9 研究表明花粉败育与花粉和花药中游离脯氨酸含量的变化密切相关。张丽等10 研究表明淀粉含量、可溶性糖及游离脯氨酸在不育系萝卜花药中显著低于保持系。因此,推测植物雄性不育的主要是由花药发育过程中营养物质缺乏引起的。能量代谢对植物生命个体而言具有十分重要的作用,植物的正常生长与发育以植物能进行正常的能量代谢为前提。【本研究切人点】以丹参和滇丹参及其正交后代为材料,观察花的形态
18、以及测定不同大小花蕾的生理生化指标。【拟解决的关键问题】探索丹参和滇丹参正交后代杂种不育的原因,为丹参新种质的开发利用提供理论支持。1材料与方法1.1供试材料选取2 0 19年云南农业大学农学院中药材研究所筛选的滇丹参(云南蒙自)为父本、引自河南的丹参为母本进行杂交获得正交后代F1。以亲本及其正交后代为试验材料,2 0 2 0 年6 月至2 0 2 1年11月西南农业学报种于云南农业大学试验农场。所用亲本丹参和滇丹参经云南农业大学郭凤根教授鉴定。1.2试验方法1.2.1花粉活力测定2 0 2 1年4月、7 月、10 月采集丹参、滇丹参及其正交后代的花粉粒,用解剖针将花粉挑出,放置于载玻片上的清
19、水中,搅动水滴,使花粉分散,分别利用TTC与I-KI对花粉进行染色,待染色完成后利用蔡司显微镜观察花粉粒颜色,找到花粉粒相对分散的视野在同一面积视野内对染色花粉粒数进行统计。3种材料每个月各进行1次花粉活力测定,共进行3次花粉活力测定,取平均值。花粉活力(%)=视野内被染色花粉数/视野内所有花粉数10 0。1.2.2花的形态观察于花期对2 个亲本及其正交后代植株进行定点取样,每株30 朵小花,分别来自主花序上、中、下3个部位,每个部位各10 朵。花瓣上下唇瓣的长宽及花丝、花药长度利用游标卡尺进行测量,用Excel进行数据统计、SPSS进行数据分析,比较正交后代与2 个亲本的差异。1.2.3生理
20、生化指标测定选择不同时期的花蕾(现蕾期到盛花期)用数码游标卡尺准确测量花蕾大小后依据花蕾长度将其分为5个发育阶段(造胞细胞时期:花蕾长度 1.5mm;花粉母细胞时期:花蕾长度1.5 3.5mm;四分体时期:花蕾长度3.55.5mm;单核期:花蕾长度5.5 7.5mm;成熟期:花蕾长度7.5 9.5mm),将样品放入冰盒内带回试验室后剥去花萼,称取每个发育阶段的样品1.5g,3次重复。利用液氮速冻后研磨,立即测定SOD、POD、C A T 活性;再称取6 g样品液氮速冻,研磨置于-8 0 冰箱冻存用于可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量的测定。测定结果取3次重复的平均值。G-250
21、考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量;可溶性糖测定采用葱酮比色法;游离脯氨酸测定采用酸性节三酮法;MDA含量测定采用TBA36卷10期法;SOD活性测定采用NBT法;POD活性测定采用愈创木酚法;CAT活性测定采用高锰酸钾滴定法,以上试验均参照李合生 的方法进行。采用Excel2010记录并整理数据、采用SPSS做显著性分析。2结果与分析2.1花粉活力测定如图1所示,对丹参、滇丹参及其正交后代花粉粒分别进行TTC、I-K I染色,滇丹参和丹参的花粉粒被TTC染液染成红色,被I-KI染成蓝黑色,说明滇丹参与丹参的花粉粒具有活力;而正交后代的花粉粒经TTC染色,花粉粒未呈现红色;I-KI染色后正交后代花
22、粉粒也未呈现出蓝黑色,说明正交后代花粉粒无活力。2 0 2 1年4月、7 月、10 月对丹参、滇丹参及正交后代花粉进行TTC染色,在3次花粉活力的测定结果中,滇丹参的花粉活力最低为8 6%,最高达99.47%,3次平均花粉活力为94.6 3%;丹参花粉活力最低为8 6.1%,最高达98.93%,3次平均花粉活力为91.6 1%;而正交后代最高的花粉活力仅2%,3次平均花粉活力为1.7 6%,即平均花粉败育率为9 8.2 4%。在3次花粉活力检测的I2-KI染色中,滇丹参的花粉活力最低为7 1.43%,最高为100%。3次平均花粉活力为8 6.7%;丹参的花粉活力最低为91.2 3%,最高达10
23、 0%,3次平均花粉活力为95.16%,而正交后代中花粉活力最高仅3.6 7%,3次平均花粉活力为2.56%,即平均花粉败育率为邹转等:丹参与滇丹参正交后代育性鉴定及花部形态与生化活性是亲本的1.6 倍以上。图2-B显示,在前4个时期,丹参与滇丹参及其正交后代在花蕾发育过程中可溶性蛋白的变化趋势大致相同,均呈上升趋势。但从单核期到成熟期,正交后代中可溶性蛋白含量急剧下降,滇丹参与丹参的可溶性蛋白含量却依然呈上升趋势。正交后代可溶性蛋白含量在前4个时期均高于2 个亲本;成熟期时,正交后代的可溶性蛋白含量显著低于亲本,此时2个亲本可溶性蛋白含量是正交后代的1.7 倍以上。215397.44%。故判
24、断正交后代为雄性不育株系。2.2花的形态观察2个亲本的花丝长度存在显著差异,正交后代的花丝长度介于亲本之间,但与2 个亲本均无显著差异;3种材料的花药长度间均存在显著差异。正交后代花瓣的上下唇长、宽均介于2 个亲本之间;丹参花瓣的上唇长、宽均小于正交后代和滇丹参,但正交后代和滇丹参间无显著差异;丹参花瓣的下唇长、宽均大于正交后代及滇丹参,但正交后代和滇丹参间无显著差异,正交后代花瓣的下唇长、宽均介于2个亲本之间(表1)。2.3生理生化指标比较与分析图2-A显示,在整个花蕾发育过程中,正交后代与滇丹参、丹参的MDA含量均呈上升趋势,尤其是正交后代MDA含量在四分体到成熟期呈明显上升趋势。在整个发
25、育过程中,正交后代MDA含量均高于2 个亲本,到成熟期时,正交后代的MDA含量500um500um500umAB500mA、B、C依次为丹参、滇丹参、正交后代TTC染色结果;D、E、F依次为丹参、滇丹参、正交后代I-KI染色结果。A,B and C are the TTC staining results of S.miltiorrhiza,S.yunnanensis and theirF generations;D,E and F are the I-KI staining results of S.milti-orrhiza,S.yunnanensis and their Fi gener
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