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胆盐水解酶筛选及酶法提制鸡胆汁酸的研究.pdf
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1、2023年第45卷第9期China Poultry Vol.45,No.9.2023研究简报研究简报doi:10.16372/j.issn.1004-6364.2023.09.016Screening of Bile Salt Hydrolase and Its Application in EnzymaticExtraction of Chicken Bile AcidLU Fangyun1,2,ZOU Ye1,2,3,LI Pengpeng1,2,MA Jingjing1,2,YANG Jing1,2,XU Weimin1,2,YANG Biao1,2,3*,WANG Daoying1,2
2、*(1.Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Science,Nanjing,Jiangsu 210014;2.Key Laboratory of Agricultural Products Cold Chain Logistics Technology,Ministry ofAgriculture and Rural Affairs,Nanjing,Jiangsu 210014;3.College of Food and Bioengineering,Jiangsu Univ
3、ersity,Zhenjiang,Jiangsu 212001)Abstract:This study aimed to screen of common bifidobacterium strains producing bile salt hydrolase to obtain high efficient strain and use its enzyme for the extraction of chicken bile acid.The BSH activities of five common bifidobacterium strainswere screened using
4、plate Ca2+precipitation method and ninhydrin method.The crude enzyme of the most active strain was used for收稿日期:2022-09-28;修回日期:2023-02-15基金项目:国家现代农业产业技术体系(CARS-41)作者简介:卢方云(1997-),女,硕士研究生,研究方向为畜禽副产品的高值化开发和综合利用,E-mail:*通讯作者:杨彪(1984-),男,博士,助理研究员,主要从事动物源副产物综合利用研究,E-mail:;王道营(1979-),男,博士,研究员,主要从事肉品加工与质量
5、控制研究,E-mail:胆盐水解酶筛选及酶法提制胆盐水解酶筛选及酶法提制鸡胆汁酸的研究鸡胆汁酸的研究卢方云1,2,邹烨1,2,3,李鹏鹏1,2,马晶晶1,2,杨静1,2,徐为民1,2,杨彪1,2,3*,王道营1,2*(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京210014;2.农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室,江苏南京210014;3.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013)摘要:试验旨在从常见双歧杆菌筛选获得高活性胆盐水解酶的菌株并用于鸡胆汁酸的提制。从5种常见双歧杆菌菌株(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌)中,通过平板Ca2+沉淀法及茚三
6、酮法对活性双歧杆菌进行酶活评价,将高活性菌株的粗酶用于鸡胆汁酸的提制,使用薄层色谱法和高效液相法对所制胆汁酸进行定性和定量检测。结果显示:4种双歧杆菌(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和乳双歧杆菌)对甘氨型和牛磺型鹅去氧胆酸均具有水解活性,婴儿双歧杆菌对甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比酶活均显著高于其他3种双歧杆菌(P0.05),比酶活分别为0.48 U/mg和0.27 U/mg。酶法工艺提制鸡胆汁酸的得率为5.34%,提取物中鹅去氧胆酸(CDCA)含量为70.7%。结果表明:婴儿双歧杆菌具有高活性胆盐水解酶,酶法工艺提制鸡胆汁酸反应条件温和,提取物纯度较高,较为节能环保。关键词:胆汁
7、酸;鹅去氧胆酸;双歧杆菌;胆盐水解酶;乳酸菌中图分类号:TS251.9文献标识码:A文章编号:1004-6364(2023)09-106-07-1062023年第45卷第9期China Poultry Vol.45,No.9.2023胆汁酸(Bile acids,BAs)是一类以胆烷酸为母核结构的分子,主要由胆固醇在肝脏合成,是胆汁的主要成分,通常以结合胆盐的形式存在于动物胆汁中1。BAs除了在膳食脂质吸收和胆固醇的稳态代谢中发挥重要作用外,还作为信号分子调节系统内分泌功能2-3。BAs类成分通常作为医药被应用于临床,如其中的熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)和鹅
8、去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)均可作为临床常用药物,用于治疗胆固醇结石4、胆汁淤积性疾病5、原发性胆汁性肝硬化6-7等。CDCA主要从牛、羊等畜胆汁中提制获得,而UDCA是熊胆的特有成分8,自然来源稀缺,主要以结构相近的胆汁酸类成分通过结构改造得到9-14。CDCA与UDCA互为立体异构体,仅结构中7位羟基的立体构象不同,医药生产中常常以CDCA为原料合成获得UDCA15,因此CDCA的市场需求量较大。但由于全球需求激增以及牛、羊胆汁供应不足等,需寻找替代来源。鸡胆作为鸡肉加工的副产物,产量巨大,且鸡胆汁中具有高含量的CDCA,占总胆汁酸的80%。由于鸡胆中C
9、DCA主要以甘氨型和牛磺型结合胆盐形态存在,需要将其解离出来进行提制。传统工艺需要使用强碱高温下长时间的皂化反应,使用强碱且耗能高,急需研究安全、高效、绿色的胆汁酸提取替代工艺16-18。鸡胆汁中结合态形式胆盐可被胆盐水解酶解离为游离态形式存在,如图1所示,生物酶法工艺节能环保,已成为当前提制研究的热点19-20。胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)是微生物在生长过程中产生的代谢产物,通常为胞内酶,目前从乳酸菌中筛选BSH的研究主要倾向于其在胆汁酸代谢及肝肠循环中的作用21-23、影响宿主的脂质代谢和胆固醇的动态平衡作用24-26以及改善食用动物的生长性能和饲料效率作用
10、27-28,但从动物胆汁中提制胆汁酸的高活性BSH筛选研究较少,仅有少量专利报道29。国内外研究表明乳酸菌广泛含有BSH,其酶活强弱因菌种、生长环境等多种因素差异而相差较大,其中双歧杆菌中胆盐水解酶活性较强30。本研究以BSH酶解甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸后的甘氨酸和牛磺酸生成量作为BSH活性的判定指标,从5种常见双歧杆菌(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌)中筛选获得高活性胆盐水解酶优良菌株,并将其应用于鸡胆汁酸的提制,为后续BSH提制动物胆汁酸的应用提供依据。the extraction of chicken bile acid.Qualitative a
11、nd quantitative detection of bile acids was performed using thin layer chromatography and high performance liquid chromatography.The results showed that 4 bifidobacterium strains(Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium adolescentis and Bifidobacterium lactis)had hydrolysis a
12、ctivities against glycine-type andtaurine-type chenodeoxycholic acid.Among them,the specific enzyme activities of Bifidobacterium infantis against GDCA and TDCA were significantly higher than those of the other 3 bifidobacterium strains(P0.05),0.48 U/mg and 0.27 U/mg respectively.Inaddition,the prel
13、iminary study on the extraction of chicken bile acid using enzymatic process showed that the yield of bile acid was5.34%,and the content of CDCA was 70.7%.The results suggested that bifidobacterium infantis had a highly active bile salt hydrolyzing enzyme,which could be used to extract chicken bile
14、acids with a mild reaction condition,high extract purity,and more energy-saving and environmental protection.Key words:bile acid;chenodeoxycholic acid;Lactobacillus;bifidobacterium;bile salt hydrolase图1鸡胆汁主要胆盐的酶解反应图1材料与方法1.1鸡胆白羽鸡胆由江苏润丰食品有限公司提供。1.2主要试剂及仪器主要试剂:MRS培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司产品);甘氨鹅去氧胆酸(GCD研究简报
15、研究简报-1072023年第45卷第9期China Poultry Vol.45,No.9.2023研究简报研究简报CA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙酸钠、茚三酮(均为源叶生物科技有限公司产品);甘氨酸、牛磺酸(SIGMA公司产品);考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所产品);双歧杆菌菌粉(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌,活性乳酸菌含量为200亿cfu/g,均是西安雅图生物公司产品)。主要仪器:高效液相色谱仪(Waters e2998型,XBridge-C18色谱柱,WATERS 公司);电子分析天平(QUINTIX124-
16、1CN型,德国赛多利斯天平公司);数控超声波清洗器(KQ5200DB,昆山市超声仪器有限公司);数显恒温水浴锅(HH-4,常州国华电器有限公司);旋转蒸发仪(RE-2000B,上海亚荣生化仪器厂);超声波细胞破碎仪(WW-1000T,上海微弥超声波有限公司);离心机(Centrifuge5810R型,Eppendorf公司)。1.3胆盐水解酶的活性测定1.3.1平板Ca2+沉淀法定性检测BSH活性31MRS-THIO-OX培养基:在MRS培养基中添加 0.2%巯基乙酸钠、0.37 g/L CaCl2、0.2%甘氨鹅去氧胆酸或牛磺鹅去氧胆酸。取 3 g 双歧杆菌菌粉,用磷酸盐缓冲液(0.01 m
17、ol/L,pH 7.0)洗涤离心两次,用含10 mmol/LDTT 的磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH 6.0)重悬,调整OD600=1.8,超声(800 W 10 min),离心(4,10 000 r/min,10 min),即得各双歧杆菌胆盐水解酶粗酶液,-20 保存备用。将灭菌融化的MRS-THIO-OX培养基倾入无菌平板中,待培养基凝固后,在平板上滴加10 L粗酶液,待平板液体吸收后置37 放置4 h。培养基中分别添加甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸进行对比,若培养基中有白色沉淀圈生成则为阳性,没有为阴性。1.3.2茚三酮法定量检测酶活力32茚三酮显色液:茚三酮按 1%比例溶解于
18、0.5 mol/L柠檬酸缓冲液中(pH 5.5);在0.5 mL上述溶液中加入1.2 mL甘油和0.2 mL 0.5 mol/L柠檬酸缓冲液。按照1.3.1方法制备双歧杆菌胆盐水解酶粗酶液,取制备的粗酶液和 200 mmol/L GCDCA/TCDCA各50 L加入到100 L磷酸盐缓冲液中(0.01 mol/L,pH 6.0),混合均匀后,置于37 孵育1 h,结束后加等体积15%三氯乙酸终止酶反应,空白组在孵育前添加三氯乙酸。反应结束后,离心(4,10 000 r/min,10 min),取50 L上清液加入到950 L茚三酮显色液中,加热煮沸15 min,在570 nm处测定吸光值;粗酶
19、液蛋白含量测定使用考马斯亮蓝法;标准曲线通过甘氨酸和牛磺酸绘制,称取一定质量的甘氨酸和牛磺酸配成30 mmol/L标准溶液,稀释得不同浓度。以OD570处吸光度为纵坐标,甘氨酸和牛磺酸浓度为横坐标绘制标准曲线。酶活力单位定义如下:1 min内产生1 mmol/L氨基酸的量为一个酶活单位(U)。酶活力(U/mL)=b-a粗酶液体积(mL)1时间(min)式中,b为样品组氨基酸含量;a为空白组氨基酸含量;比酶活:酶活力/蛋白含量,单位:U/mg。1.4鸡胆汁酸提制1.4.1鸡胆汁提取取鸡胆适量,低温冷冻结块,切24 mm厚片置于过滤网,室温解冻使胆汁自然流出,收集胆汁。1.4.2皂化法提制鸡胆汁酸
20、取胆汁100 mL平均分为5份,分别加入35 mL耐压管,每管中各加入2 g NaOH于110 油浴中加热进行皂化反应,连续皂化22 h,分别于5 h、16 h、18 h、20 h、22 h进行取样,冰浴冷却终止反应,并将各样品调至pH为23进行沉淀,离心,沉淀层使用清水洗涤两次,干燥,称重、计算得率,待测含量。1.4.3酶法提制鸡胆汁酸筛选一种高活性菌株,制备双歧杆菌胆盐水解酶粗酶液冻干粉:按1.3.1方法制得双歧杆菌胆盐水解酶粗酶液,将制得的粗酶液在-80 冻存24 h至粗酶液完全冻结,将冷冻粗酶液干燥48 h至呈干粉状,于-20 保存备用。取鸡胆汁250 mL,加少量盐酸调节pH 5.4
21、,加高活性双歧杆菌胆盐水解酶粗酶冻干粉1.5 g、丁酯150 mL,于水浴37 条件下搅拌5 h至酶反应完全,静止分层取丁酯层,使用200 mL碱液萃取,下层溶液使用盐酸(18%)调pH为23酸沉,离心,沉淀层使用清水水洗两次,干燥、称重、计算得率,待测含量。1.4.4薄层色谱分析取适量鸡胆汁酸粉末溶解于甲醇中,使用毛-1082023年第45卷第9期China Poultry Vol.45,No.9.2023研究简报研究简报细管(直径0.05 mm)点样于GF254薄层色谱硅胶板上,使用展开剂(氯仿 甲醇=20 1)进行展开,使用纯水进行显色。1.4.5高效液相色谱分析对照品和样品制备:取鹅去
22、氧胆酸对照品和鸡胆汁酸粉末溶于甲醇分别配置成1 mg/mL的溶液,待用。色谱条件:Waters-C18色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m),采用等度洗脱,体积流量为1 mL/min;进样量为20 L;柱温为30。检测条件:ELSD检测器(Gain:50,Neb:12,Tube:60,Gas:30 psi)。流动相:A相为0.1%甲酸水溶液,B相为乙腈,A B(20 80)。1.5统计与分析数据使用Excel 2010与SPSS 19.0软件处理分析,采用LSD法进行多重比较,结果以(平均数标准差)表示,以P0.05为差异显著性标准。采用Origin 9.0软件作图。2结果与分析2.1胆盐
23、水解酶活性定性检测结果MRS-THIO-OX平板筛选产胆盐水解酶菌株见图2。4种双歧杆菌(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和乳双歧杆菌)粗酶液在含甘氨鹅去氧胆酸和含牛磺鹅去氧胆酸培养基上都产生了明显印记,而长双歧杆菌未产生印记,表明两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和乳双歧杆菌都具有水解甘氨型和牛磺型鹅去氧胆酸的活性,而所测的长双歧杆菌对两种胆盐均未显示水解活性。2.2活性菌胆盐水解酶活性评价2.2.1甘氨酸、牛磺酸标准曲线的绘制甘氨酸和牛磺酸标准曲线分别见图3、图4。甘氨酸标准曲线方程为 y=0.142 8x-1.681 5,R2=0.999 2;牛磺酸标准曲线方程为 y=0.
24、244 1x-1.425 8,R2=0.999。表明甘氨酸在 1630 mmol/L和牛磺酸在820 mmol/L内与OD570处吸光度线性关系良好。2.2.24种双歧杆菌胆盐水解酶活力定量检测结果4种双歧杆菌胆盐水解酶活力定量检测结果见表1。4种双歧杆菌(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和乳双歧杆菌)对甘氨型和牛磺型鹅去氧胆酸均具有水解活性,其中婴儿双歧杆菌对甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比酶活均显著高于其他3种双歧杆菌(P0.05),其比酶活分别为0.48 U/mg和0.27 U/mg。图2MRS-THIO-OX平板筛选产胆盐水解酶菌株注:1、2、3、4、5分别代表两歧双歧杆菌、婴
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