大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 231大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析向凡舒1,2,蔡文超1,2,郭 壮2,刘慧杰3,余海燕4,单春会1,*(1.石河子大学食品学院,新疆特色果蔬贮藏加工教育部工程研究中心,新疆 石河子 832000;2.湖北文理学院 湖北省食品配料工程技术研究中心,湖北 襄阳 441053;3.北京忠和房县生物食品有限公司,湖北 十堰 442100;4.湖北庐陵王酒业有限责任公司,湖北 十堰 442100)摘 要:为揭示大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性,在采用电子舌对其各滋味指标进行数字化评价的基础上,进一步对有机酸和氨基酸的种类及含量进行解析
2、,同时对其蕴含的乳酸菌类群进行分离鉴定,并采用MiSeq高通量测序技术对其细菌类群进行了揭示和功能预测,最后对各滋味指标与细菌类群的相关性进行计算。结果显示,大竹米酒在咸味、酸味和苦味指标上的差异较大,米酒中含有7 种有机酸和15 种氨基酸,其中有机酸以乳酸(8.82 mg/g)和乙酸(6.27 mg/g)为主,氨基酸以谷氨酸(8.06 mg/g)、亮氨酸(4.10 mg/g)和天冬氨酸(3.94 mg/g)为主。通过纯培养共分离出14 株乳酸菌,鉴定为5 个种,分别为发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum,4 株)、戊糖片球菌(Pediococcus pent
3、osaceus,4 株)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei,2 株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,2 株)和假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides,2 株)。高通量测序结果表明,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为平均相对含量大于1.0%的细菌门,累计含量达96.93%;乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leu
4、conostoc)和不动杆菌属(Acinetobacter)为平均相对含量大于1.0%的细菌属,累计含量达89.43%。相关性分析表明,Weissella与后味A、涩味和苦味等滋味指标存在显著负相关(P0.05)。由此可见,大竹米酒中有机酸以乳酸和乙酸为主,氨基酸以谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸为主,细菌类群以Lactobacillus、Pediococcus和Weissella等乳酸菌为主,且Weissella对米酒品质的形成具有积极意义。关键词:米酒;电子舌;有机酸;氨基酸;细菌类群Correlation between Taste Quality and Bacterial Community
5、 of Dazhu Rice WineXIANG Fanshu1,2,CAI Wenchao1,2,GUO Zhuang2,LIU Huijie3,YU Haiyan4,SHAN Chunhui1,*(1.Engineering Research Center for Storage and Processing of Xinjiang Characteristic Fruits and Vegetables,Ministry of Education,College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Hubei
6、 Provincial Engineering and Technology Research Center for Food Ingredients,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;3.Beijing Zhonghe Fangxian Bio-Food Co.Ltd.,Shiyan 442100,China;4.Hubei Lulingwang Wine Industry Co.Ltd.,Shiyan 442100,China)Abstract:This study was undertaken to r
7、eveal the correlation between the taste quality and bacterial community of Dazhu rice wine.Taste attributes were measured using an electronic tongue,the types and contents of organic acids and amino acids were analyzed,and lactic acid bacteria were isolated and identified from the rice wine.Moreover
8、,analysis and functional prediction of its bacterial community were carried out using MiSeq high-throughput sequencing technology.Finally,the correlation between various taste attributes and bacterial community was calculated.The results showed that Dazhu rice wine varied widely in terms of saltines
9、s,sourness and bitterness.The rice wine contained seven organic acids and 15 amino acids,the predominant organic acids being lactic acid(8.82 mg/g)and acetic acid(6.27 mg/g),and the predominant amino acids being glutamic acid(8.06 mg/g),leucine(4.10 mg/g)and aspartic acid(3.94 mg/g).A total of 14 la
10、ctic acid bacteria were isolated by pure culture and identified as five species,namely Limosilactobacillus fermentum(four strains),收稿日期:2022-08-29基金项目:新疆建设兵团中青年领军人才项目(2020CB025);南疆重点产业支撑计划项目(2018DB002);湖北文理学院教师科研能力培育基金“科技创新团队”项目(2020kypytd009)第一作者简介:向凡舒(1998)(ORCID:0000-0002-7151-5672),女,硕士研究生,研究方向为
11、农产品加工。E-mail:*通信作者简介:单春会(1978)(ORCID:0000-0003-1896-3502),男,教授,博士,研究方向为农产品加工。E-mail:sch_232 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程Pediococcus pentosaceus(four strains),Lacticaseibacillus paracasei(two strains),Lactiplantibacillus plantarum(two strains)and Leuconostoc pseudomesenteroides(two strains).High-throu
12、ghput sequencing results showed that the average relative contents of Firmicutes and Proteobacteria were greater than 1.0%,with a cumulative content of 96.93%;the relative contents of Lactobacillus,Pediococcus,Weissella,Lactococcus,Leuconostoc and Acinetobacter were greater than 1.0%,with a cumulati
13、ve content of 89.43%.Correlation analysis showed a significant negative correlation(P 0.05)between Weissella and taste indicators such as aftertaste A,astringency and bitterness.These findings showed that the major organic acids in Dazhu rice wine were lactic acid and acetic acid,that the major amin
14、o acids were glutamic acid,leucine and aspartic acid,and that bacterial community was dominated by lactic acid bacteria such as Lactobacillus,Pediococcus and Weissella.Weissella could have a positive significance on the formation of rice wine quality.Keywords:rice wine;electronic tongue;organic acid
15、s;amino acids;bacterial community structureDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0231-08引文格式:向凡舒,蔡文超,郭壮,等.大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析J.食品科学,2023,44(18):231-238.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347.http:/XIANG Fanshu,CAI Wenchao,GUO Zhuang,et al.Correlation betw
16、een taste quality and bacterial community of Dazhu rice wineJ.Food Science,2023,44(18):231-238.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347.http:/米酒,又称醪糟,其作为国酒的起源,酿造历史源远流长1,因酒香浓郁、口感甘甜和营养丰富,深受中国和日本等亚洲国家人群的喜爱2。在米酒的发展历程中,相关从业人员对其酿造工艺进行了许多创新,例如在米酒制作中添加其他原料,增添营养组分或提升风味3;使用酵母和酶
17、制剂代替传统米酒曲进行纯种发酵,减少能耗,提高效率4。除了酿造工艺,微生物对米酒品质的形成亦发挥了关键作用5,因而许多科研人员开始解析米酒和米酒曲中的微生物群系。通过比较江苏苏州与湖北宜昌地区米酒的微生物类群,Lu Yucai等6发现苏州米酒中的真菌以扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和米根霉(Rhizopus oryzae)为主,宜昌米酒以米根霉和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)为主;两个地区米酒中的细菌均以柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和微小杆菌属(Exiguobacterium)为主,且细菌多样性要显著大于真
18、菌多样性。Zhao Xinxin等7对湖北、四川和广西地区米酒曲的细菌群落结构进行解析,结果发现它们的细菌组成较为相似,均以魏斯氏菌属(Weissella)为主,但在细菌结构上,湖北和四川地区的米酒曲更为相似,广西地区较为不同。此外,日本的一项研究发现,即便在使用以酵母为主的发酵剂发酵时,米酒中仍存在着较多的细菌类群8。上述研究表明米酒和米酒曲中的微生物形成可能受到了原料来源、地域环境和发酵过程等多重因素的影响,且细菌在米酒的发酵过程中发挥了不可或缺的作用。我国四川省大竹县拥有“醪糟之乡”的美誉,当地米酒被列入在我国国家地理标志产品名列之中。然而目前针对大竹米酒的研究还鲜见报道,因而全面解析大
19、竹米酒的品质以及细菌群落结构十分必要。随着技术的不断更新,电子舌等一系列仿生设备凭借其检测快速和数据实时监测等特点逐渐取代了冗长而费力的常规检测方法,在食品质量检测领域占据了极大的优势9。Illumina MiSeq是实现测序高效、准确且低成本的理想平台,亦是使用最为广泛的第二代测序平台之一,在医学、生物和农业领域均被广泛应用10。目前也作为解析大曲11、泡菜12和黄酒13等众多发酵食品微生物类群的主要方法之一。本研究在使用电子舌对大竹米酒滋味品质实现数字化评价的基础上,对其有机酸和游离氨基酸种类及含量进行测定,采用纯培养法对其中的乳酸菌进行分离鉴定和保藏,结合MiSeq高通量测序技术解析其细
20、菌群落结构,并对细菌菌群与滋味品质间的关联性进行探究,最后将大竹米酒与恩施米酒的细菌群落结构及菌群功能进行比较分析,以期为推动当地米酒的产业化发展提供一定的理论参考依据,对农产品推广起到一定的积极影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂米 酒 于 2 0 2 1 年 5 月 采 集 自 四 川 省 大 竹 县(E1065910732,N30203100)西门综合市场和兴光农贸市场。M R S 合 成 培 养 基 青 岛 海 博 生 物 技 术 有 限公司;宏基因组DNA提取试剂盒 德国QIAGEN生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 233公司;10Buffer、dNTP缓冲液
21、、Taq DNA聚合酶 和 T 载 体 宝 生 物 工 程(大 连)有 限 公 司;正/反向引物338F/806R(正向引物序列338F:5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3;反向引物序列806R:5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)上海桑尼生物科技有限公司。1.2 仪器与设备SA402B电子舌(配备传感器CA0、C00、AE1、CT0、AAE、GL1和2 个参比电极)日本Insent公司;PHS-3C数显台式酸度计 上海越平科学仪器有限公司;LC-20ADXR高效液相色谱仪 日本岛津公司;Biochrom 30全自动氨基酸分析仪 英国Biochrom公司;Vetiri
22、梯度基因扩增仪 美国AB公司;UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司;R930机架式服务器 美国Dell公司;MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。1.3 方法1.3.1 样品采集及处理从四川大竹县西门综合市场和兴光农贸市场共采集米酒样品7 份,编号为DZ1DZ7。所采集的样品均为当地农户家庭制作,制作步骤如下:首先将糯米浸泡6 h,然后进行蒸饭、摊凉和淋饭,待其温度降至32 时加入研磨成粉的米酒曲拌匀,之后将米饭装入容器中铺平并轻轻压实,中心处挖一个洞,接着在容器口盖上纱布,最后用棉被包裹整个容器保温发酵23 d。当米酒发酵好后,中心的洞会盛有汁水。将采集
23、到的样品分别装入无菌采样袋中低温下运送回实验室,置于40 冰箱中备用。1.3.2 米酒滋味品质的数字化评价样品预处理:称取30 g米酒样品于烧杯中,加入120 mL纯水,搅拌均匀后转移至200 mL离心杯,5 000 r/min离心10 min,取上清液进行抽滤,将收集到的滤液置于40 备用。之后参照王玉荣等14方法使用电子舌对米酒的滋味指标进行测定。1.3.3 米酒pH值和有机酸组分及其含量测定参照酸度计使用说明书,使用pH 6.86和pH 4.00的标定液对酸度计进行两点标定,继而测定米酒的pH值。有机酸含量测定样品前处理:称取10.0 g米酒样品置于研钵中研碎后,将其转移至50 mL容量
24、瓶中,使用流动相(0.01 mol/L K2HPO4溶液)定容,充分混匀后吸取1.5 mL匀液至2 mL EP管中,12 000 r/min离心3 min,取上清液使用0.22 m滤膜过滤备用。参照王丹丹等15的方法制备7 种有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸)的标准溶液,并采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法对有机酸组分及含量进行测定。1.3.4 氨基酸组分及其含量测定样品前处理方法参照GB 5009.1242016食品中氨基酸的测定,预处理完成后参照马佳佳等16的方法将样品上机检测。1.3.5 乳
25、酸菌分离、纯化和鉴定参照张振东等17的方法对米酒中乳酸菌菌株进行初步筛分并保藏,提取疑似乳酸菌菌株DNA,对序列进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增、产物清洁和连接转化,最后挑取阳性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测序返回的序列上传至NCBI网站(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对确定其物种信息。1.3.6 样品宏基因组DNA提取、PCR扩增及测序使用试剂盒提取米酒中细菌的宏基因组DNA,提取的DNA置于20 备用。在对序列进行PCR扩增前,先在引物中添加核苷酸标签(barc
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