大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义.pdf
《大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、中国实用神经疾病杂志 2023 年 10 月第 26 卷第 10 期Chinese Journal of Practical Nervous Diseases Oct.2023,Vol.26 No.10【摘要】目的研究肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法成年雄性 SD 大鼠 100 只,按随机数字表分为对照组(n=50)和损伤组(n=50),通过改良 Allen s 的方法构建动物模型,建模后于 12、1 d、3 d、5 d、7 d 5 个时间点分别随机选取 10 只大鼠,处死后取损伤区脊髓组织,伊文斯蓝检测血-脊髓屏障通透性,通过 RT-PCR 及 Wester
2、n blot 法检测 MLCK 的 mRNA 与蛋白表达和磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)的蛋白表达。结果损伤组血-脊髓屏障通透性较对照组显著增高(P0.05)。损伤组各时间点 MLCK 的 mRNA 与蛋白表达以及 P-MLC 蛋白表达较对照组显著增高(P0.05)。结论大鼠脊髓损伤后MLCK表达增加可能参与血-脊髓屏障功能损害的发生机制。【关键词】脊髓损伤;血-脊髓屏障;肌球蛋白轻链激酶;磷酸化肌球蛋白轻链【中图分类号】R-332【文献标识码】A【文章编号】1673-5110(2023)10-1286-05基金项目:重庆市渝中区科技局厅局级项目(编号:20200135)崔敏刘阳唐小勇邓永兵
3、重庆市急救医疗中心 重庆市第四人民医院,重庆 400010通信作者:刘阳大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义DOI:10.12083/SYSJ.230448本文引用信息:崔敏,刘阳,唐小勇,邓永兵.大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义 J.中国实用神经疾病杂志,2023,26(10):1286-1290.DOI:10.12083/SYSJ.230448Reference information:CUI Min,LIU Yang,TANG Xiaoyong,DENG Yongbing.Expression and significanceof myosin light chain k
4、inase after spinal cord injury in rats J.Chinese Journal of Practical Nervous Diseases,2023,26(10):1286-1290.DOI:10.12083/SYSJ.230448论著科研之窗Expression and significance of myosin light chain kinase after spinal cord injury in ratsCUI Min,LIU Yang,TANG Xiaoyong,DENG YongbingChongqing Emergency Medical
5、Center/The Fourth People s Hospital of Chongqing,Chongqing 400010,ChinaCorresponding author:LIU Yang【Abstract】ObjectiveTo study the expression and significance of myosin light chain kinase(MLCK)after spinal cord injury(SCI)in rats.MethodsOne hundred adult Sprague-Dawley male rats were randomlydivide
6、d into control group(n=50)and injured group(n=50)according to the random number table.The modelwas established on the basis of the modified Allen s method.Ten rats were randomly selected at 5 time pointsof 12 h,1 d,3 d,5 d and 7 d after modeling.The permeability of blood-spinal cord barrier was dete
7、cted byEvans blue.The protein and mRNA expression of MLCK and the protein expression of phosphorylation of myosinlight chain(P-MLC)were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe blood-spinal cord barrierpermeability in the thoracic pulp injured group was increased markedly than that in the cont
8、rol group(P0.05).The protein and mRNA expression of MLCK and P-MLC protein expression of thoracic pulp injured group weresignificantly increased at each time point compared with control group(P0.05).ConclusionThe increasedexpression of MLCK may be involved in the mechanism of blood-spinal cord barri
9、er dysfunction after spinal cordinjury in rats.【Key words】Spinal cord injury;Blood spinal cord barrier;Myosin light-chain kinase;Phosphorylation ofmyosin light chain脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后出现的神经功能障碍如肢体瘫痪、大小便失禁、呼吸困难等恢复时间长且效果差,因此需进一步研究脊髓损伤后的病理生理机制,为改善脊髓损伤患者的预后提供理论支持的依据。血-脊髓屏障(blood spinal cord ba
10、rrier,BSCB)通1286中国实用神经疾病杂志 2023 年 10 月第 26 卷第 10 期Chinese Journal of Practical Nervous Diseases Oct.2023,Vol.26 No.10透性改变是脊髓损伤后重要的病理生理过程1-3。紧密连接是BSCB的重要组成部分,主要参与细胞旁途径的分子、离子通透过程,对维持BSCB正常屏障 功 能 起 重 要 作 用4-7。肌 球 蛋 白 轻 链 激 酶(myosin light chain kinase,MLCK)分布于内皮细胞、肌 细 胞 等,其 重 要 作 用 是 催 化 肌 球 蛋 白 轻 链(myo
11、sin light chain,MLC)磷酸化8-11。文献 12 报道,MLCK通过磷酸化MLC(P-MLC),使紧密连接产生机械收缩,从而紧密连接破坏,屏障通透性增加。本研究通过检测大鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障的通透性,以及MLCK、P-MLC的表达,探讨大鼠脊髓损伤后MLCK表达与血-脊髓屏障通透性的关系,为进一步研究脊髓损伤后的病理生理基础并提高脊髓损伤患者的有效防治措施提供理论依据。1材料和方法1.1材料与试剂于本校实验动物中心购买100只成年雄性 SD 大鼠,体质量 200260 g。伊文斯蓝(Evans blue,EB)购自上海跃腾生物技术有限公司。小鼠抗大鼠MLCK抗体(ab76
12、092)购自美国abcam公司。小鼠抗大鼠 P-MLC 抗体(sc-166720)、-actin(sc-130301)购自美国santa公司。化学发光试剂盒购自 GE 公司。PrimeScript RT reagent Kit With gDNAEraser(Perfect Real Time)、PageRuler PrestainedProtein Ladder购买于宝生物工程有限公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购买于上海碧云天生物技术有限公司。山羊抗小鼠 IgG(BA1001)由武汉博士德生物工程公司提供。Trizol提取试剂、100 bp Ladd
13、er marker购自于宝生物工程有限公司。生工生物工程有限公司提供设计并合成MLCK及-actin引物。1.2方法1.2.1制作SD大鼠脊髓损伤模型:依据改良Allen s法13-15制作SD大鼠的脊髓损伤模型,利用无菌注射器于腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg,麻醉妥当后固定大鼠。无菌剪剪开椎板(T9T10),充分显露硬脊膜后定位于脊髓(T9T10)。以质量为20 g的Allen s打击器从高度25 mm自由落体击打胸髓后建立模型。成功构建模型的标准:通过打击器打击后的SD大鼠尾反射阳性,双后肢表现为回缩及扑动,硬脊膜的表面出现水肿及充血。对照组 SD 大鼠只进行T9T10的锥板剪除并暴
14、露硬脊膜。术后常规创口无菌换药,辅助SD大鼠的排尿直至正常。本研究制模成功率82.9%,为保证本实验大鼠数量的恒定,及时补充制模失败的大鼠。1.2.2SD大鼠分组及采集标本:利用随机数字表法将所有SD大鼠分为对照组(n=50)和胸髓损伤组(n=50),于建模成功后的12 h、1 d、3 d、5 d、7 d 5个时间点,在损伤组以及对照组中随机抽取SD大鼠10只,经断头法处死。每组SD大鼠的其中5只通过无菌手术方法切取胸髓损伤段的脊髓标本,以 DEPC 水(11 000)冲洗3次,置入80 冰箱内保存,用于逆转录PCR及蛋白印迹(Western blot)检测,另外5只SD大鼠检测伊文斯蓝的含量
15、。1.2.3SD大鼠的血-脊髓屏障的通透性检测:通过伊文斯蓝测定SD大鼠的血-脊髓屏障通透性的改变。在处死SD大鼠前2 h,无菌注射器自SD大鼠的股静脉注射2%EB溶液(20 mg/kg),EB染料分布均匀的指征包括有SD大鼠的眼睛和足趾均变为蓝色。通过断头的方法处死SD大鼠。无菌手术切取损伤段的胸髓组织,切取长度2 cm。利用吸水过滤纸去除胸髓表面水分并称质量。通过10%三氯乙酸分离损伤段的胸髓蛋白质,在无水乙醇中均匀化,3次离心循环后加入甲酰胺(3 mL),54度水浴(24 h)后抽取上清液。利用分光光度计测量吸光度(波长632 nm),最后制作EB标准曲线并获取EB含量。1.2.4RT-
16、PCR法检测MLCK mRNA表达:大鼠MLCK上游引物:5-CGCCACTTCCAGATAGACTAC-3,下游引物:5-ACCTTCCTCCATCGTTTCC-3,产物长度294 bp。取出存贮于80 冰箱的SD大鼠的胸髓标本,依据Trizol方法获取胸段的胸髓损伤组织的微小血管的总RNA,通过微量分光光度计检测提取样品中的RNA浓度和纯度。将RNA逆转为cDNA:其中除去基因组 DNA 的反应体系包括 5gDNA EraserBuffer(2 L),gDNA Eraser(1 L),Total RNA(1 L),RNase Free dH2O(10 L);逆转录体系包括:5PrimeSc
17、ript Buffer(4 L),PrimeScript RT EnzymeMix I(1 L),RT Primer Mix(1 L),去除DNA的反应液10 L,RNase Free dH2O 20 L。实时定量PCR反应以cDNA为模板,-actin为内参进行,反应条件:95 预变性5 min,95 变性15 s,60 退火35 s,40个循环,最后72 延伸5 min。通过CT值比较实时定量PCR结果,并以-actin为内参。1.2.5Western-blot 检测 MLCK 及 P-MLC 的蛋白表达:取标本加入免疫沉淀裂解液,匀浆后离心,留取上清液,BCA法测定上清液中蛋白浓度。煮沸
18、5 min后蛋白样品变性,离心5 min(10 000 r/min)后上样。电泳后(10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶)通过半干转移法1287中国实用神经疾病杂志 2023 年 10 月第 26 卷第 10 期Chinese Journal of Practical Nervous Diseases Oct.2023,Vol.26 No.10转至硝酸纤维膜。5%脱脂奶粉封闭后依次与稀释后的一抗(MLCK 11 000,P-MLC 11 000)4 孵育过夜,室温下与HRP标记的二抗(12 000)孵育1 h,采用化学发光法显色。以-actin为内参作对照,定量测量平均吸光度,以样本平均吸光度与内参-
19、actin之比值代表MLCK、P-MLC相对表达量。1.3统计学方法各组连续变量的实验值以xs表示,2组均数比较采用两独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。所有数据在SPSS 25.0软件中进行统计分析,以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1血-脊髓屏障通透性测定EB测定SD大鼠血-脊髓屏障的通透性,胸髓损伤组呈现显著的蓝染。对照组在各个时间点上伊文斯蓝含量无显著变化。胸髓损伤组在各个时间点上的伊文斯蓝含量较对照组升高明显(P0.05),胸髓损伤组不同时间点的EB含量无统计学差异(P0.05)。见图1。2.2MLCK mRNA表达结果对照组各时间点的MLCK
20、mRNA表达无显著变化。胸髓损伤组各时间点MLCK mRNA表达较对照组显著增加(P0.05),胸髓损伤组不同时间点MLCK mRNA表达无统计学差异(P0.05)。见图2。2.3MLCK 蛋白表达结果对照组各时间点的MLCK 表达无显著变化。胸髓损伤组各时间点的MLCK表达较对照组显著增加(P0.05),胸髓损伤组不同时间点MLCK表达无统计学差异(P0.05)。见图3。2.4P-MLC 蛋白表达结果对照组各时间点的P-MLC表达无明显变化。胸髓损伤组各时间点的P-MLC表达较对照组显著增加(P0.05)。胸髓损伤组不同时间点 P-MLC 的表达无统计学差异(P0.05)。见图4。3讨论ML
21、CK属于免疫蛋白超家族,由氨基端肌动蛋白结合区域、中心激酶区域、钙调蛋白结合区域、羧基端肌球蛋白结合区域构成。MLCK广泛分布于肌细胞及非肌细胞中,主要催化MLC磷酸化,同时也参与调节细胞的黏附、游走,血管生成等。SHI等16报道,MLCK 参与调节中性粒细胞穿过血管内皮细胞。ELLENM等17研究发现,MLCK参与调节周围神经髓鞘细胞的分化、细胞骨架的构成及髓鞘的形成,MLCK表达下调,髓鞘形成受阻。PETER等18报道,敲除大鼠MLCK基因,会降低高浓度氧诱导的肺血管内皮细胞活性氧增加,缓解肺内炎症反应,同时肺内血管的高通透性得到降低。本研究通过对EB含量的检测,发现大鼠胸髓损伤后血-脊髓
22、屏障的通透性增加。BSCB的改变是AB胸髓损伤组对照组12 h1 d3 d5 d7 d12 h1 d3 d5 d7 d相对 mRNA 水平胸髓损伤组对照组-actin注:与同时间点胸髓损伤组比较,aP0.05;胸髓损伤组不同时间点之间比较,bP0.05图2大鼠胸髓损伤区不同时间点MLCK mRNA表达水平A:MLCK mRNA定量分析;B:RT-PCR检测MLCK mRNA表达Figure 2MLCK mRNA expression levels at differenttimepointsinratthoraciccordinjuryregion.A:Quantitativeanalysis
23、ofMLCKmRNA;B:RT-PCRdetected MLCK mRNA expression胸髓损伤组对照组EB含量/(g/g)12 h1 d3 d5 d7 d图1大鼠胸髓损伤区不同时间点EB含量Figure 1EB content at different time points in ratthoracic cord injury zone注:与同时间点胸髓损伤组比较,aP0.05;胸髓损伤组不同时间点之间比较,bP0.051288中国实用神经疾病杂志 2023 年 10 月第 26 卷第 10 期Chinese Journal of Practical Nervous Disease
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 大鼠 脊髓 损伤 肌球蛋白 链激酶 表达 意义
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。