大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析.pdf
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1、麦类作物学报2 0 2 3,43(10):12 3412 40Journal of Triticeae Crops网络出版时间:2 0 2 3-0 8-2 9网络出版地址:https:/lin k.c n k i.n e t/u r lid/6 1.1359.S.2 0 2 30 8 2 8.1144.0 0 2大麦醇溶蛋白启动子HorD 的克隆及其种子特异性表达分析doi:10.7606/j.issn.1009-1041.2023.10.02刘宝龙,姜燕燕1,曹东,常砚梓,李云1(1.中国科学院西北高原生物研究所/青海省作物分子育种重点实验室,青海西宁8 10 0 0 0;2.青海大学农林科
2、学院,青海西宁8 10 0 0 0)摘要:种子特异性启动子的克隆和功能分析不仅有助于阐明作物种子发育和胚乳特异性基因的表达调控机制,也是进行作物品质改良和种子生物反应器在内的植物基因工程改造的基础。本研究从大麦品种Goldenpormise中克隆到大麦胚乳特异性启动子HorD,生物信息学分析表明,其具备启动子的基本元件,如A-box、T A T A-b o x、C A A T-b o x 等,此外还含有胚乳特异性表达所需要的元件Prolamin-box。为验证HorD启动子的表达特性,以pU1300载体为骨架,将HorD启动子和新型冠状病毒(SARA-CoV-2)刺突蛋白基因LPS通过双酶切连
3、接的方式构建表达载体phorD-LPS,并利用农杆菌介导的遗传转化试验验证其种子表达特性。结果表明,HorD启动子能驱动LPS基因在转基因大麦各组织中表达,但在根、茎、叶及颖壳中表达量较低,在种子中表达量较高。这说明HorD启动子可以驱动外源目的基因在大麦种子中特异高效表达。关键词:大麦;HorD启动子;顺式作用元件;遗传转化中图分类号:S512.3;S330Cloning of HorD Promoter and Its Seed-Specific Expression Analysis in BarleyLIU Baolong,JIANG Yanyan.2,CAO Dong,CHANG Y
4、anzi,LI Yun(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences/Qinghai Province Key Laboratory of CropMolecular Breeding,Xining,Qinghai 810000,China;2.Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Abstract:The cloning and functional analyses of seed-specific promoters not only help
5、to clarify themechanisms of crop seed development and expression regulation of endosperm-specific genes,but alsoprovide the basis for plant genetic engineering,including crop quality improvement and crop seed reac-tors.In this study,the barley endosperm-specific promoter HorD was cloned from the bar
6、ley cultivarGolden promise.Bioinformatics analysis showed that the promoter not only had the basic elementssuch as A-box TATA-box,and CAAT-box,but also contained the element Prolamin-box,which wasendosperm-specific expressed element.In order to verify the expression characteristics of HorD pro-moter
7、,the vector phorD-LPS was constructed with restriction enzyme digestion with HorD promoterand the cloned novel coronavirus(SARA-CoV-2)spike protein gene LPS through double enzyme lig-and used pU1300 vector as the skeleton.Its seed expression characteristics were verified by Agrobacte-rium-mediated s
8、table genetic transformation experiments.The results showed that HorD promotercan drive the expression of LPS gene in transgenic barley tissues,and the expression level was lowerin roots,stems,leaves and glume,but higher in seeds.The results above indicated that the HorDpromoter can drive the specif
9、ic and efficient expression of foreign gene of interest in barley seeds.Keywords:Hordeum ulgare L.;HorD promoter;Cis-acting element;Genetic transformation启动子是决定基因时空特异性表达的重要因收稿日期:2 0 2 2-0 9-2 0修回日期:2 0 2 2-10-2 4基金项目:大麦生物反应器的创制及新型冠状病毒植物源疫苗的研发(2 0 2 1-ZJ-931)第一作者 E-mail.blliunwipb.cas,cn通讯作者:李云(E-mai
10、l:)文献标识码:AQinghai University,Xining,Qinghai 810000,China)素之一,分为组成型、组织特异性和诱导型三种类文章编号:10 0 9-10 41(2 0 2 3)10-12 34-0 7第10 期型1。目前报道的一些组成型启动子,例如烟草花叶病毒35S(C a M V 35S)和玉米Ubiquitin启动子,被广泛应用于植物基因工程领域2-3,但不能满足特定基因在特定组织表达的需求。胚乳特异性启动子具有明显的组织和发育阶段特异性,可使外源基因在转基因植物种子胚乳中高效、特异表达,避免了非特异表达对植物造成的不利影响4。目前在水稻(Oryza sa
11、tiva L.)5-6 、小麦(Triticum aestivum L.)7-、玉米(Zea maysL.)和大麦(Hordeum vulgare L.)1o l 中已发现多种胚乳特异性表达启动子,但其中的大多数启动子由于表达特性不稳定等导致其应用受到限制1-12 。在同一个植物中频繁使用同一种启动子驱动多个不同基因表达容易造成基因沉默现象13-14。为探明胚乳特异性基因的调控机理,需克隆更多的胚乳特异性表达启动子15-16 。大麦醇溶蛋白是一种大麦胚乳特有的贮藏蛋白,占胚乳总蛋白的50%6 0%17,其基因启动子HorD具有胚乳特异性表达特性。转基因植物作为生物反应器,具有完整的真核表达系统
12、,可为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰,表达具有生物活性的外源蛋白,可应用于人或动物的疾病治疗及预防。相较于叶片、茎等表达系统,种子生物反应器具有产量高、生产成本低、储藏能力强、安全性高、远离动物携带的病菌等优点18-19。新型冠状病毒(SARA-CoV-2)刺突蛋白是开发重组疫苗的最佳候选蛋白,利用大麦种子生物反应器生产SARA-CoV-2抗原蛋白,实现抗原蛋白在种子中的大量积累,是抗击新型冠状病毒肺炎疫情的一种新策略。本研究以大麦品种Goldenpromise为材料,克隆大麦醇溶蛋白启动子HorD,将该启动子和新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS利用双酶切进行连接,构建植物表达载体phorD-L
13、PS,通过农杆菌介导的遗传转化法获得大麦转基因株系,并分析HorD启动子的表达特性,以期为大麦胚乳特异型启动子HorD的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料供试植物材料为春大麦Golden promise(Hordeum vulgare ssp.distichum),属于二棱皮大麦,二倍体,含有5310 8 个碱基。培养条件为18光照16 h,15黑暗8 h。大肠杆菌DH5和刘宝龙等:大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析1.2启动子的克隆及序列分析利用CTAB法2 0 1提取大麦叶片基因组DNA,根据 Golden promise参考基因组(GPvl,INSDC Asse
14、mbly GCA_902500625.1)中 D-hor-dein基因(EF417989)的5端序列,用PrimerPremier5.0软件设计HorD启动子的特异性引物,在正向引物Hord-F中加上PstI酶切位点,在反向引物Hord-R中加上BamHI酶切位点(表1),采用常规PCR方法扩增大麦HorD的启动子序列,PCR反应体系为50 L,包括2 San TaqPCR Mix 25 L,引物 Hord-F/R(10 mol L-1)各1L,基因组DNA1L,d d H O补足至50L。PC R反应程序:94预变性5min;94变性30 s,55退火30 s,7 2 延伸1min,32个循
15、环;7 2 再延伸10 min,4保温。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根,北京)对PCR产物进行回收。利用PlantCare在线网站(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)预测启动子含有的顺式作用元件。1.3phorD-LPS植物表达载体的构建以pU1300载体为骨架,用HorD替换Ubi启动子,构建pU1300-phorD载体,具体步骤:将pU1300载体和HorD启动子片段分别用限制性内切酶PstI和BamHI进行双酶切,酶切总反应体系为50 L,包括10 XFast Digest Green buffe
16、r5 L,DNA 20 L,PstI 和 BamHI 各 2.5 L,ddHO补足至50 L。混匀后在PCR仪中37 酶切30 min。凝胶电泳后的pU1300骨架和HorD启动子片段分别进行胶回收,利用T4连接酶将二者连接,连接体系为 10 L,包括Linervector DNA 1 L,Insert DNA 3 L,1o X T4DNA Ligase Buffer 1 L,T4 DNA Ligase 0.5L,ddHzO补足至10 L。通过热激法将连接产物转人大肠杆菌DH5中,挑取阳性克隆并测序,获得pU1300-phorD载体。最后用限制性内切酶BamHI和 SacI将新型冠状病毒刺突蛋
17、白基因LPS(3918 b p)片段(由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)连接至载体pU1300-phorD,获得PhorD-LPS表达载体(方法同上),然后再进行双酶切鉴定,将正确的质粒送交测序。:12 3 5农杆菌EHA105分别购自上海生工生物工程股份有限公司和北京华越洋生物科技有限公司。质粒pU1300由本实验室保存。12361.4农杆菌介导的大麦遗传转化将大麦幼胚用7 0%的酒精表面消毒30 s,用灭菌水洗涤数次后,再用10%的次氯酸钠浸泡4min,用灭菌水洗涤数次,然后用无菌滤纸擦干表面水分。将消毒过的大麦幼胚放人OD600=0.6的农杆菌菌液中,振荡培养2 0 min,倒掉菌液,将
18、愈伤组织转移到无菌滤纸上,吸干表面残留的菌液,转人共培养培养基中,置于2 4培养箱中暗培养3d,再转至含50 mgL-1 HYG(潮霉素)的抑菌筛选培养基进行培养,每隔14d继代一次,将生长状态良好且致密的愈伤组织转移到含30mgL-1HYG的分化培养基上,2 4光照培养。待分化出绿芽后,转移至含30 mgL-1HYG的再生筛选培养基上进行培养。每隔14d继代一次,待绿苗长至2 3cm,转移至含30mgL-1 HYG的生根培养基中,待再生苗根系足够发达以及叶片健壮时,进行炼苗,一般为6 7d,待炼苗完成后移栽至土壤中。移栽前需用自来水将残留的培养基冲洗干净。1.5转基因植株的PCR检测及LPS
19、基因的表达模式分析以植物表达载体phorD-LPS上的LPS为目标基因,用PrimerPremier5.0软件设计引物LPS-F/R,以T。代抗性植株的叶片DNA为模板,以phorD-LPS载体为阳性对照,以野生型大麦叶片DNA为阴性对照,进行PCR检测。PCR反应体系为50 L,包括2 XSanTaqPCRMix25L,引物 LPS-F/R(10 molL-1)各1L,基因组DNA1L,dd HzO补足至50 L。PC R反应程序:9 45min;9 430 s;5515s;7 2 1min,35个循环;7 2 10 min,4保温。用 FastPure Plant Total RNA Is
20、olation Kit(诺唯赞,南京)分别提取转基因大麦的根、茎、叶、内麸、外麸及种子总RNA。用PrimeSricptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(Takara,北京)将RNA反转录为 cDNA。以 LPS-F/R为引物(表1),以大麦ARF1为内参基因。使用ChamQUni-versal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,南京)进行qRT-PCR。PC R反应体系参照试剂盒说明书,PCR反应程序:9 5预变性30 s;9 5变性5s,52退火34s,7 2 延伸2 0 s,40 个循环。每个样品3个生物学重复。采用2-ACT法计算基因的相
21、对表达量。麦类作物学报2结果与分析2.1大麦启动子HorD的克隆及植物表达载体phorD-LPS 的构建结果以大麦基因组DNA为模板,利用特异性引物Hord-F/R进行PCR扩增,得到大麦HorD启动子片段(图1A),回收目的片段后进行测序,得知启动子HorD的全长为450 bp。用限制性内切酶BamHI 和 SacI 将新型冠状病毒刺突蛋白基因LPS片段连接至载体pU1300-phorD,获得PhorD-LPS表达载体,经 PCR验证和测序,发现所得片段(436 8 bp)与预期结果一致(图1B和1C),表明构建的载体phorD-LPS正确,可用于后续分析。表1本研究所用的引物序列Table
22、 1IPrimers used in this study引物名称引物序列(5-3)Primer namePrimer sequence(5-3)Hord-FAAAAACTGCAGCTTCGAGTGCCCGCCGATTTGHord-RCCATGGATCCCAGCCGCTTAGCCATCTCGGLPS-FGGCACCATTACGGACGCLPS-RGGGGAAACACCATAGCACTTARF1-FCGGTAGTTCTACTTCTGTTCARF1-RCATCTCTGTATATGCATCAG下划线部分为酶切位点序列。The underlined part is the sequence of en
23、zymatic sites.2.2HorD启动子区域含有的顺式作用元件PlantCare在线网站分析结果(表2)表明,HorD启动子除含有必需的基本顺式作用元件(A-box、T A T A-b o x 和CAAT-box)外,还包含一个胚乳特异性表达元件Prolamin-box。2.3农杆菌介导的大麦遗传转化及转基因植株检测通过农杆菌介导的遗传转化法将LPS启动子转入大麦基因组中(图2 A)。以大麦转基因植株叶片基因组DNA为模板,以LPS-F/R为引物对转基因植物进行PCR检测,结果(图2 B)表明,在所检测样品中,有6 株能够扩增出与目的片段大小相同的条带,表明这6 株再生苗为阳性植株。2
24、.4LPS基因在转基因大麦不同组织中的表达量从图3可以看出,LPS基因在大麦不同组织中均有表达,但表达量存在差异。以根中LPS基第43卷第10 期刘宝龙等:大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析.1237A450bpLBA:大麦HorD启动子的克隆结果;B:phorD-LPS载体的构建结果;C:p h o r D-LPS载体示意图。A图和B图中,M:DL5000;1和2为两个重复。A:Cloning result of HorD promoter in barley;B:Construction results of phorD-LPS vector;C:Schematic d
25、iagram of phorD-LPSvector.In figures A and B,M:DL5000;1 and 2 were two repelicates.Fig.1 Cloning result of HorD promoter in barley and construction result of phorD-LPS expression vector元件名称元件序列Element nameElement sequenceA-boxCCGTCCCAAT-boxCAAAT/CCAAT/TGCCCAACCCGTCC-boxCCGTCCDRE1ACCGAGAProlamin-boxT
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