川陈皮素对慢传输型便秘小鼠的治疗作用及机制研究.pdf
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1、2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 川陈皮素对慢传输型便秘小鼠的治疗作用及机制研究黄礼1,韦祎2,刘英莲2(1.海口市第三人民医院 海口 571100;2.海南医学院中医学院 海口 571199)摘要:目的探讨川陈皮素(NOB)对慢传输型便秘(STC)小鼠的治疗作用及其机制。方法随机将小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组(莫沙必利,2.5 mgkg-1)及NOB低、中、高剂量组(10、20、4
2、0 mgkg-1),每组12只。模型组和给药组均采用盐酸洛哌丁胺诱导STC小鼠模型,造模成功后给予相应药物灌胃处理,每天1次,共2周。检测各组小鼠24 h内排便量、粪便含水量、肠道推进率及结肠肌电变化;HE染色观察各组小鼠结肠组织病理学变化;ELISA法检测各组小鼠结肠组织中5-羟色胺(5-HT)、血管活性肽(VIP)、一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性;Western blot检测各组小鼠结肠组织中干细胞因子(SCF)和酪氨酸激酶受体(c-kit)蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组小鼠结肠损伤明显,24 h排便量、粪便含水量、肠道推进率、结肠肌电慢波振幅及结肠组织中SCF和
3、c-kit蛋白表达均显著降低(P0.05),而结肠肌电慢波频率、结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平显著升高(P0.05);与模型组比较,NOB中、高剂量组及阳性对照组小鼠结肠损伤减轻,24 h内排便量、肠道推进率、结肠肌电慢波振幅及结肠组织中SCF和c-kit蛋白表达均显著升高(P0.05),而结肠肌电慢波频率及结肠组织中 5-HT、VIP、NO 和 NOS 水平均显著降低(P0.05)。结论NOB可通过调节结肠肌电、增强肠道神经传递、促进肠道推进,从而改善STC小鼠排便情况,其作用机制可能与上调SCF和c-kit蛋白表达有关。关键词:川陈皮素 慢传输型便秘 肠神经 干细胞因子/酪氨
4、酸激酶受体doi:10.11842/wst.20211231002 中图分类号:R285.5 文献标识码:A慢传输型便秘(Slow transit constipation,STC)是一种以结肠运动功能障碍为特点的肠道疾病,伴有肠内容物在结肠上传输缓慢,粪便次数减少且干燥等临床现象1。由于现代饮食、生活习惯等方式的多样,导致STC患病率高居不下,使患者的生活质量变差,经济负担加重,严重时可引起肠道危重急病,危害生命,而且病因和发病机制目前尚不明确,因此STC的临床治疗和机制研究刻不容缓。有研究显示,STC可能与肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)、胃肠道 Caja
5、l间质细胞(Interstitial cell of Cajal,ICCs)和平滑肌细胞组成的肠运动调控有关,ENS或ICCs失调可导致平滑肌松弛,引起结肠运动减弱,促成STC疾病的产生,而调节ENS和ICCs,可改善STC2。干细胞因子/酪氨酸激酶受体(Stem cell factor-C-kit,SCF/C-kit)信号通路在疼痛感知、胃肠动力紊乱和炎症异常激活中均有重要作用,参与STC中ENS和ICCs失调3。推测,STC主要的发病机制可能是SCF/c-kit信号通路。众多研究发现STC治疗方式常以西药为主,长期服用可引起心血管、内分泌等系统的不良反应,因此寻找一种高效且低毒副作用的治疗
6、药物成为最新研究方向1-3。中医 收稿日期:2021-12-31 修回日期:2022-10-04 国家自然科学基金委员会地区科学基金项目(81860816):基于异功散中陈皮对肠吸收动力学影响的“补而不滞”配伍机制研究,负责人:韦祎。通讯作者:刘英莲,硕士,副教授,主要研究方向:中医方面的研究。1736 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究药作为新型研究项目,在治疗胃肠疾病方面效果显著,有很多中药
7、单体均表现出强有力的治疗效果并且副作用小。中药陈皮具有治疗胸腹胀满、脾虚饮食减少、消化不良以及恶心呕吐等疾病,常与其他药材同用 达 到 通 润 肠 道 治 疗 便 秘 的 作 用,而 川 陈 皮 素(Nobiletin,NOB)作为从陈皮分离出的一种黄酮类化合物,具有抗真菌、抗炎作用,可双向调控大鼠空肠段平滑肌的收缩性,促进胃肠动力4-5。说明NOB针对胃肠蠕动具有一定的科学依据,但NOB对STC是否有治疗作用尚未可知,并且具体的治疗机制也不明确。因此,本研究通过构建 STC小鼠模型,探讨 NOB对 STC小鼠结肠运动功能的影响及其作用机制,为临床开发治疗STC相关药物提供科学依据。1 材料与
8、方法 1.1实验动物SPF级KM小鼠72只,雌性,8周龄,体质量25-28 g,购自华中农业大学,动物生产许可证号:SCXK(鄂)2020-0019。小鼠于SPF条件下饲养,温度(241),相 对 湿 度 50%-55%,明 暗 光 照 各 12 h,适 应 性 饲养7天。1.2实验试剂及仪器盐酸洛哌丁胺购自美国sigma公司;川陈皮素(纯度98%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司;莫沙必利、活性炭、阿拉伯树胶粉购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;小鼠 5-羟色胺(5-HT)、血管活性肽(VIP)和一氧化氮合酶(NOS)ELISA试剂盒购自武汉华美生物有限公司;小鼠一氧化氮(NO)ELISA试剂
9、盒购自上海心语生物科技有限公司;SCF抗体、c-kit抗体和-actin抗体购自英国Abcam公司;电泳仪(型号:164-5050)美国 BIO-RAD 公司;正置显微镜(型号:DM4B)购自德国徕卡公司;全功能酶标仪(型号:SpectraMax iD3)购自美国Molecular Devices公司。生物机能实验系统(型号:BL-420F)购自长春添月科技有限公司;自制银丝电极,直径0.4 mm,长12 mm。1.3实验方法1.3.1STC模型构建及分组将 KM 小 鼠 随 机 分 为 正 常 组(CON)、模 型 组(MOD)、阳 性 对 照 组(PC)和 NOB 低(NOB-L)、中(N
10、OB-M)、高剂量(NOB-H)组,每组 12 只。除 CON组外,其余组小鼠均采用盐酸洛哌丁胺诱导STC小鼠模型6:小鼠按照 3 mgkg-1d-1剂量灌服盐酸洛哌丁胺,每天2次(9 00和17 00),连续14天。检测造模后各组小鼠排便量及粪便含水量情况,若造模后数据明显低于造模前,确定STC小鼠建模成功6,剔除造模不成功的小鼠并及时补充。造模成功后,NOB-L、NOB-M和NOB-H组小鼠给予10、20、40 mgkg-1d-1的NOB灌胃,PC 组小鼠给予 2.5 mgkg-1d-1莫沙必利灌胃,CON组和MOD组小鼠给予等量生理盐水,每天1次,共2周。1.3.2排便量和粪便含水量测定
11、在造模前、造模后及药物干预后3个时间点,将各组小鼠置于代谢笼中自由饮水活动24 h,收集小鼠粪便,统计排便量并称重记录,随后将粪便放入65烘箱中烘干6 h后称取干重,计算其含水量。粪便含水量(%)=(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重100%。1.3.3活性炭推进实验检测肠道传输功能药物干预结束后,各组小鼠按照0.1 mL10 g-1剂量灌胃活性炭混悬液(浓度为:100 gL-1,配置方法:称取阿拉伯树胶粉50 g,加水400 mL,煮沸至溶液透明,称取活性炭25 g加入上述溶液中煮沸3次,待溶液凉后加水定容至500 mL);灌胃完30 min后,采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉各组小鼠,沿腹部中线切开
12、腹腔,暴露全部肠道,在松弛状态下测量从幽门到直肠末端肠道的全长及活性炭混悬液在肠道内推进的长度,并计算肠道推进率。肠道推进百分率(%)=(活性炭前端与幽门的距离/肠道全长)100。1.3.4结肠肌电测定活性炭推进实验结束后,小鼠仰卧于手术台上,在距离盲肠约1.5 cm结肠浆肌层内植入两根银丝电极,两者相距约0.5 cm,同时引入BL-420F生物机能实验系统,0.5 h 后开始测定,灵敏度选择:标准电压1 mVcm-1,时间常数 1 s,高频滤波 1 Hz,连续记录1 h。将各组结果每180 s作为一个时间单位,并计算出该时间内慢波频率和振幅的均数、标准差和变异系数;变异系数(%)=(标准差/
13、均数)100。1.3.5HE染色取各组小鼠结肠组织1 cm,采用4%甲醛固定,剩余结肠组织采用PBS冲洗干净后装入冻存管-80保存。取已固定24 h的结肠组织,放入由低到高浓度乙醇除去组织水分,以二甲苯替换组织中的酒精,浸蜡包埋冷却凝固成蜡块;将蜡块切成薄片(厚5 m)、展1737 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 片、置于载玻片上45烘干;制备好的石蜡切片经脱蜡、至水、苏木精水溶液-酒精
14、伊红溶液分批染色,再次脱水、透明,中性树胶封固。切片于显微镜下观察结肠组织病理形态变化。1.3.6ELISA 法检测结肠组织中 5-HT、VIP、NO 和NOS水平取100 mg结肠组织放入0.9 mL预冷的PBS(pH=7.4)置于匀浆机中充分研磨均匀,3000 rmin-1离心20 min,取20 L上清,按照ELISA试剂盒说明书进行加样、室温温育、洗板,最后在波长450 nm处进行比色读数,测定结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平。1.3.7Western blot检测结肠组织中c-kit和SCF蛋白表达取适量结肠组织,采用 RIPA裂解液抽提组织蛋白,使用BCA蛋白浓度测定试
15、剂盒检测蛋白浓度。取25 g蛋白样品与 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液混合,100加热5 min充分变性蛋白,电泳1.5 h分离蛋白,切胶、剪膜、滤纸、转PVDF膜,室温封闭1 h,依次加入c-kit(1 1000)、SCF(1 1000)和内参-actin(1 1000)抗体,4孵育过夜。次日,TBST洗脱3次,加入稀释过的 HRP 标记的二抗(1 10000)室温孵育 1 h,TBST洗脱3次,按照ECL化学发光检测试剂盒说明书进行显影拍照。采用Image J软件计算各个蛋白灰度值,计算出目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参-actin的灰度值。1.3.8数据处理采用SPSS 2
16、1.0软件进行统计分析,计量数据以均值标准差(x s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,事后两两比较采用LSD-t检验。以P0.05),造模后,与 CON组比较,MOD、PC、NOB-L、NOB-M、NOB-H 组小鼠24 h 排便量和粪便含水量降低,差异有统计学意义(P0.05),说明出现STC疾病现象,即粪便次数减少且干燥;经药物干预后,与CON组比较,MOD组小鼠排便量和粪便含水量降低,差异有统计学意义(P0.05);与MOD组比较,PC、NOB-M、NOB-H组小鼠排便量和粪便含水量升高,差异有统计学意义(P0.05)。提示 NOB对 STC小鼠的排便情况有缓解作用,且缓解程度与给药
17、剂量呈正比。2.2NOB对小鼠肠道推进率的影响与CON组比较,MOD组小鼠肠道推进率降低,差异有统计学意义(P0.05),而PC、NOB-M、NOB-H组小鼠肠道推进率升高,差异有统计学意义(P0.05),其中 PC 和 NOB-H 组肠道推进率最高。表明NOB可有效促进肠道推进,加快排便。见表3。2.3NOB对小鼠结肠肌电慢波活动的影响如表4所示,与CON组比较,MOD组小鼠频率、频率变异系数和振幅变异系数升高,振幅降低,差异有统计学意义(P0.05);与 MOD 组比较,PC、NOB-M、NOB-H组小鼠频率、频率变异系数和振幅变异系数降低,振幅升高,差异有统计学意义(P0.05),PC和
18、NOB-表1各组小鼠各时间点24 h排便量变化(x s,n=12)组别CONMODPCNOB-LNOB-MNOB-HF值P值造模前排便量(颗)102.174.22102.173.71102.004.8699.834.0298.833.88100.674.481.3350.261造模后排便量(颗)104.334.9968.673.57*71.835.13*69.004.80*71.007.01*72.165.95*80.719P0.001药物干预后排便量(颗)102.834.7671.333.96*93.674.71#71.504.1681.506.65#93.503.89#88.371P0.0
19、01注:与CON组比较,*P0.05;与MOD组比较,#P0.05。表2各组小鼠各时间点24 h粪便含水量变化(x s,n=12)组别CONMODPCNOB-LNOB-MNOB-HF值P值造模前粪便含水量(%)67.172.1267.752.2265.412.5765.831.8566.582.1967.082.231.8950.107造模后粪便含水量(%)67.751.7144.171.58*42.581.67*42.412.02*43.411.44*43.331.37*445.987P0.001药物干预后粪便含水量(%)66.752.0942.832.12*61.582.06#42.581
20、.2449.671.43#61.501.44#420.018P0.001注:与CON组比较,*P0.05;与MOD组比较,#P0.05。1738 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究H组结肠肌电效果最佳,说明NOB具有增强结肠肌电活动的能力。2.4NOB干预后小鼠结肠组织病理变化如图1所示,CON组结肠组织黏膜层完整,杯状细胞形态和数量正常。MOD组结肠组织肌层变薄,黏膜层破损,腺体腔变窄、杯状细
21、胞减少,并且固有层及黏膜下层有大量炎症细胞浸润;NOB-L组结肠组织病理变化与模型组相似,出现明显的腺体腔变窄、杯状细胞减少现象。与模型组比较,PC、NOB-M、NOB-H组结肠组织有所改善,且PC、NOB-H组改善最为明显,表现为肌层变厚,杯状细胞和腺体腔恢复正常,无炎症细胞浸润,基本接近于CON组;而NOB-M组结肠组织肌层比 PC、NOB-H 组肌层薄,存在少数腺体腔变窄。2.5NOB对小鼠结肠组织5-HT、VIP、NO和NOS水平的影响如表5所示,与CON组比较,MOD组小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平升高,差异有统计学意义(P0.05);与 MOD 组比较,PC、NO
22、B-M、NOB-H组小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平降低,差异有统计学意义(P0.05)。说明NOB可降低STC小鼠结肠组织中肠神经递质的活性。表4NOB对小鼠结肠肌电慢波活动的影响(x s,n=12)组别CONMODPCNOB-LNOB-MNOB-HF值P值频率(Hz)1.310.436.520.57*1.630.75#5.500.603.810.72#1.830.76#137.077P0.001频率变异系数(%)10.832.9219.753.39*11.253.19#19.583.4517.332.84#11.583.26#21.816P0.001振幅(mV)0.0870
23、.0080.0160.005*0.0780.013#0.0150.0050.0550.005#0.0770.011#172.974P0.001振幅变异系数(%)16.9921.49738.7921.440*18.0331.855#37.7671.04030.1671.901#19.0337.599#104.362P0.001注:与CON组比较,*P0.05;与MOD组比较,#P0.05。表3NOB对小鼠肠道推进率的影响(x s,n=12)组别CONMODPCNOB-LNOB-MNOB-HF值P值肠道推进率(%)74.003.8853.335.22*69.757.13#56.756.4961.0
24、02.79#68.755.82#26.890P0.001注:与CON组比较,*P0.05;与MOD组比较,#P0.05。图1各组小鼠结肠组织病理学变化(HE,100)表5NOB对小鼠结肠组织中5-HT、VIP、NO和NOS水平的影响(x s,n=12)组别CONMODPCNOB-LNOB-MNOB-HF值P值5-HT(ngL-1)208.1711.61279.418.05*222.5810.77#273.6712.33258.589.66#227.089.63#96.241P0.001VIP(ngL-1)63.331.5589.332.38*65.082.90#86.173.0173.163.
25、56#65.832.88#198.634P0.001NO(molL-1)36.581.9243.751.54*37.581.56#43.331.3740.922.53#37.911.78#34.373P0.001NOS(ngmL-1)1.030.226.080.53*1.880.26#5.970.403.090.35#1.950.26#453.939P0.001注:与CON组比较,*P0.05;与MOD组比较,#P0.05。1739 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science an
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