大黄对大鼠体内肠道菌群-宿主共代谢作用的影响.pdf
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1、Vol.43 No.8 Aug.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(8)大黄对大鼠体内肠道菌群-宿主共代谢作用的影响高羽,殷姗,庞玥,梁文懿,刘玉敏上海交通大学分析测试中心,上海 201100摘要目的观察大黄对大鼠肠道菌群与机体间的平衡关系的影响。方法以Wistar大鼠为研究模型,将其随机分为4组(每组n=8),分别以大黄提取液0.1 g/kg(低剂量大黄组)、2.5 g/kg(中剂量大黄组)、4.5 g/kg(高剂量大黄组)及
2、等量生理盐水(对照组)进行灌胃,连续给药5 d。每日观察大鼠粪便含水量的变化情况。采用气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography/time of flight mass spectrometry,GC/TOFMS)技术对第5日大鼠体内血清、结肠组织、粪便的代谢物进行检测,并采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)方法分析不同剂量组与对照组间代谢物的差异,进一步采用t检验获得差异具有统计学意义的代谢物。结果大黄
3、给药后,大黄组大鼠粪便含水量随时间及剂量的增加逐渐增大。给药第5日,与对照组相比,不同剂量大黄组大鼠体内血清、结肠组织和粪便中分别检测到28、18和20种差异代谢物的水平有显著变化(P0.05),且有17种血清代谢物、2种结肠组织代谢物、10种粪便代谢物的水平变化呈现剂量效应。其中,部分神经递质类物质、吲哚类物质、胆酸类物质等肠道菌群-宿主共代谢物给药后发生了显著变化。粪便中儿茶酚、吲哚-3-乙酸的水平明显升高,而苯丙氨酸、4-氨基丁酸、左旋多巴、吲哚-3-丙酸的水平明显降低;在高剂量大黄组结肠组织中脱氧胆酸明显升高;与对照组相比,不同剂量组中血清苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的水平明显升高。此外,
4、富马酸(能量代谢相关的有机酸类物质)在大黄给药后的粪便中明显下调,而在结肠组织和血清中明显上调。随着给药剂量增大,谷氨酸(氨基酸类物质之一)水平在血清中明显递增,但在粪便中逐渐递减。除了6-磷酸葡萄糖酸外,果糖、丙酮酸、乳酸、葡萄糖-1-磷酸、D-甘油-1-磷酸等糖代谢物和二十二酸、13-二十二碳烯酸、单硬脂酸甘油酯、胆固醇等脂代谢物的水平在血清中升高,而结肠组织中D-甘油-1-磷酸和粪便中乳酸、葡萄糖-1-磷酸、亚麻酸明显降低。结论大黄通过肠道菌群-宿主共代谢作用影响了脑-肠轴、胆汁酸代谢,进一步作用于机体的能量代谢、氨基酸代谢、糖代谢和脂代谢。关键词大黄;肠道菌群;共代谢;气相色谱-飞行时
5、间质谱DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.08.007 中图分类号R285.5 文献标志码AEffect of rhubarb on gut microbiota-host co-metabolism in ratsGAO Yu,YIN Shan,PANG Yue,LIANG Wenyi,LIU YuminInstrumental Analysis Centre,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 201100,ChinaAbstract Objective To study the effect of rhubarb a
6、dministration on the balance between intestinal flora and the body.Methods Wistar rats were randomly divided into 4 groups(n=8),which were given extractions of rhubarb 0.1 g/kg(low dose group),2.5 g/kg(medium dose group),4.5 g/kg(high dose group)and normal saline(control group)by intragastric admini
7、stration for 5 d,and the daily change of fecal water content of rats was observed.Gas chromatography/time of flight mass spectrometry(GC/TOFMS)approach was used to detect the metabolites in serum,colon tissue and fecal of rats on the 5th day of administration.Principal component analysis(PCA)and par
8、tial least squares discrimination analysis(PLS-DA)were used to analyze the differences of metabolites between different dose groups and the control group.The metabolites with statistical significance were obtained by t-test.Results The water content of rat feces in the dose group gradually increased
9、 with the time and dose after rhubarb administration.Compared with the control group,28,18 and 20 differential metabolites were obtained in serum,colon tissue and fecal samples from different dose groups,which showed significant changes(P0.05)on the 5th day.At the same time,the levels of 17 serum me
10、tabolites,2 colon tissue metabolites,and 10 fecal metabolites altered significantly in a dose-dependent manner.Among these differential metabolites,some gut microbial-host co-metabolites,including neurotransmitters,indoles,and bile acids,were observed to alter significantly after rhubarb administrat
11、ion.The levels of fecal catechol and indole-3-acetic acid increased while the 论著 基础研究基金项目 上海交通大学“医工交叉”科研基金(ZH2018QNA10,YG2019QNA21)。作者简介 高 羽(1990),女,助理实验师,硕士;电子信箱:。通信作者 刘玉敏,电子信箱:。Funding Information Shanghai Jiao Tong University Fund for Interdisciplinary Research on Medicine and Engineering(ZH2018Q
12、NA10,YG2019QNA21).Corresponding Author LIU Yumin,E-mail:.9972023,43(8)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.8 Aug.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)levels of fecal phenylalanine,4-aminobutyric acid,L-DOPA,and indole-3-propionic acid decreased.Deoxycholic acid level was significantly elev
13、ated in colon tissue samples from the high-dose group.Compared with the control group,phenylalanine,tyrosine,and tryptophan levels in serum samples also increased in different dose groups.In addition,the levels of fumaric acid(one of organic acids related to energy metabolism),was down-regulated in
14、fecal samples but up-regulated in colon tissue and serum samples.With the increase of dosage,the level of glutamic acid(one of amino acids)significantly increased in serum samples but gradually decreased in colon tissue samples.Except for 6-phosphogluconic acid,the levels of carbohydrates and lipid
15、metabolites,including fructose,pyruvate,lactic acid,glucose-1-phosphate,D-glycero-1-phosphate docosenic acid,13-docosenoic acid,1-monostearoylglycerol,and cholesterol increased in the serum samples,while those of D-glycero-1-phosphate in colon tissue and lactic acid,glucose-1-phosphate,and linolenic
16、 acid in fecal samples decreased.Conclusion Rhubarb affects brain-gut axis and bile acid metabolism through the gut microbial-host co-metabolism,and further affects the bodys energy metabolism,amino acid metabolism,glycometabolism and lipid metabolism.Key words rhubarb;gut microbiota;co-metabolism;g
17、as chromatography/time of flight mass spectrometry(GC/TOFMS)肠道菌群在机体健康和疾病的微妙关系中扮演着相当重要的角色。在健康状态下,人体与肠道菌群相互作用、相互依赖,构成了微生态的平衡。一旦平衡被破坏,则通过肠道菌群-宿主共代谢作用引起机体一系列的反应。目前,肠道菌群被认为是药物靶向治疗代谢紊乱和神经系统疾病的一个潜在的新领域。大黄是临床上的常用中药,主要包含掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐 古 特 大 黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或 药 用 大 黄(Rheum officin
18、ale Baill.)的干燥根及根茎,性味苦寒,具有泻下攻积、清热泻火等功效1。已有研究发现,大黄能够有效地促进肠道的传输作用2,通过影响肠道微生物3,阻碍大鼠肠道细菌转移至肝、脾、肠系膜淋巴结,降低细菌移植量等4,尤其是对于肠源性感染非常有效。研究5-7还发现,大黄对大肠埃希菌有抑制作用,而且能够抑制临床致病性需氧菌和厌氧菌。在创伤或者感染等应激条件下,肠道的屏障作用遭到破坏,大量的细菌以及内毒素进入血液循环,引起肠源性内毒素血症和细菌的移位,并引发体内细胞因子和一些炎症介质的连锁反应8。大黄能影响肠道微生态环境,通过增强毒物的排泄减少肠道菌的移植量,在减少吸收的同时降解体内的内毒素,从而减
19、轻内毒素导致的肠黏膜屏障的破坏。大黄能改变宿主中肠道菌群的结构,从而改变宿主的代谢表型3,9-10。因此,大黄对体内菌群和宿主间的共代谢作用有很重要的影响。本研究以大鼠为研究对象,采用气相色谱-飞行时 间 质 谱(gas chromatography/time of flight mass spectrometry,GC/TOFMS)技术检测大黄给药后大鼠体内血清、结肠组织、粪便中代谢产物的变化,评估大黄对肠道菌群-宿主共代谢作用的影响,以期为临床上大黄的药理研究提供参考。1材料与方法1.1药品、试剂和仪器大黄饮片购自上海雷允上药房,经上海交通大学药学院王梦月副教授鉴定,为药用大黄(Rheum
20、 officinale Baill.)干燥的根茎。分别称取适量大黄饮片,加10倍量水浸泡1 h后研磨,超声提取30 min,离心后取上清液定容至1 000 mL。吡啶(分析纯)、甲醇(色谱纯)及氯仿(分析纯)购自德国Merk Chemicals公司,甲氧胺、L-2-氯苯丙氨酸(内标)、N,O双(三甲基硅基)三氟乙酰胺/三甲基氯硅烷(BSTFA/1%TMCS)及其他标准品购自美国Sigma-Aldrich公司。气相色谱-飞行时间质谱联用仪(7890A-Pegasus 4D,美国 Agilent 公司-美国 LECO 公司),离心机(TGL-16B,上海安亭科学仪器厂),涡旋仪(QL-901,江苏
21、海门其林贝尔仪器制造有限公司),天平(BS124S,德 国 Startorius 公 司),研 磨 仪(TissueLyser-24,上海净信实业发展有限公司),烘箱(XMTD-8222,上海精宏实验设备有限公司),真空离心浓缩仪(LNG-T88,江苏省太仓华美生化仪器厂)。1.2动物及分组雄性 Wistar 大鼠 32 只,78 周龄,体质量为(20020)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物生产许可证号为 SCXK(京)2014-0001,使用许可证号为 SYXK(沪)2018-0028。将998高羽,等大黄对大鼠体内肠道菌群-宿主共代谢作用的影响http:/上海交通大学学报(
22、医学版),2023,43(8)动物单独饲养在上海交通大学实验动物中心的代谢笼中,通风良好,温度(252),湿度(555)%。将大鼠随机分为4组,每组8只。其中3个实验组大鼠分别以大黄提取物进行灌胃,每日1次;分设不同剂量组,具体为 0.1 g/kg(低剂量大黄组)、2.5 g/kg(中剂量大黄组)、4.5 g/kg(高剂量大黄组)。对照组每日灌以等量的生理盐水11,持续5 d。给药的前1 d设为第0日。每日记录大鼠体质量,并采集粪便样本,保存于80 下备用。第5日,大鼠静脉取血,离心(4,17 225g,20 min)后取血清,保存于80 下备用。然后,对大鼠行二氧化碳安乐死,辅以颈椎脱臼处死
23、。打开腹腔,取全段结肠剖开,取距离直肠5 cm处的结肠,用消毒后的锡箔纸包好,立即置于液氮中,保存于80 下备用。1.3粪便含水量的测定精确称量50 mg粪便样本,置于已经在105 干燥至恒量的锡箔中,于105 烘箱中加热3 h,最后在干燥器内冷却。烘干前后分别称定质量,即得粪便湿质量及干质量,计算粪便含水率,粪便含水率(粪便湿质量粪便干质量)/粪便湿质量。1.4样品前处理1.4.1血清样品前处理参照相关文献12,移取血清样品100 L,加入300 L提取溶剂(氯仿甲醇)=13,涡旋1 min,20 下静置10 min,离心20 min(4,17 225g)。移取上清液 300 L,加入内标
24、10 L(1.0 mg/mL),离心浓缩后用氮气吹干。然后加入 15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液 80 L,密封后涡旋1 min,37 下反应2 h。最后加入BSTFA/1%TMCS试剂80 L,密封后涡旋1 min,70 下反应1.5 h。1.4.2结肠组织样品前处理参照相关文献13,称取结肠组织 70 mg,加 100 L 水,混匀后研磨均匀(60 Hz,2 min)。加入250 L提取溶剂(氯仿甲醇)=13,涡旋1 min,20 下静置20 min,离心20 min(4,17 225g)。移取上清液 250 L,加入内标 10 L(1.0 mg/mL),离心浓缩后用氮气吹干。然后加入 15
25、 mg/mL甲氧胺吡啶溶液 80 L,密封后涡旋1 min,37 下反应2 h。最后加入BSTFA/1%TMCS试剂80 L,密封后涡旋1 min,70 下反应1.5 h。1.4.3粪便样品前处理参照相关文献14,称取粪便 样 品 40 mg,加 入 内 标 10 L(1.0 mg/mL)及300 L水,混匀后研磨均匀(60 Hz,2 min)。加入300 L 提取溶剂(氯仿甲醇)=13,涡旋1 min,20 下静置 10 min,离心 20 min(4,17 225g)。移取上清液400 L,离心浓缩后用氮气吹干。然后加入 15 mg/mL 甲氧胺吡啶溶液 80 L,密封后涡旋 1 min,
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