大豆主要致敏蛋白及其检测技术研究进展.pdf
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1、专题论述 食品科学 2023,Vol.44,No.15 261大豆主要致敏蛋白及其检测技术研究进展邢玉飞,布冠好*,陈复生,常永锋,王美月(河南工业大学粮油食品学院,河南 郑州 450001)摘 要:大豆是常见的食物过敏原之一,能够引发严重的过敏反应。目前,由于缺乏对大豆过敏的明确治疗方法,大豆过敏人群只能避免摄入含有大豆的食物。但在实际的食品生产过程中会添加不同的食品配料,且加工过程复杂,难以准确检测部分食品中是否含有大豆过敏原。因此对于食品中大豆过敏原检测方法的研究变得尤为重要。本文主要阐述大豆中主要致敏蛋白及其结构特性,并详细总结目前用于大豆过敏原检测的主要技术,对于有效避免大豆过敏、保
2、证过敏人群生命健康具有重要意义。关键词:大豆;致敏蛋白;结构特性;检测技术Research Advances in Major Allergenic Soybean Proteins and Their Detection TechniquesXING Yufei,BU Guanhao*,CHEN Fusheng,CHANG Yongfeng,WANG Meiyue(College of Food Science and Engerneering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)Abstract:Soybean is
3、one of the common food allergens and can cause severe allergic reactions.Currently,due to the lack of a definite treatment for soybean allergy,people with soybean allergy have to avoid eating foods containing soybean protein.However,the addition of different food ingredients and complex processing d
4、uring food production can make it difficult to accurately detect the presence of soybean allergens in some foods.Therefore,researching methods for the detection of soybean allergens in foods is particularly important.This paper focuses on the major allergenic proteins in soybean and their structural
5、 properties,and summarizes the current major techniques for the detection of soybean allergens.It is expected that this review will be of significance for effectively avoiding soybean allergy and ensuring the life and health of people with soybean allergy.Keywords:soybean:allergenic proteins;structu
6、ral characteristics;detection techniquesDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220826-316中图分类号:TS207.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)15-0261-08引文格式:邢玉飞,布冠好,陈复生,等.大豆主要致敏蛋白及其检测技术研究进展J.食品科学,2023,44(15):261-268.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220826-316.http:/XING Yufei,BU Guanhao,CHEN Fusheng,et al.Research advances in
7、 major allergenic soybean proteins and their detection techniquesJ.Food Science,2023,44(15):261-268.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220826-316.http:/收稿日期:2022-08-26 基金项目:国家自然科学基金面上项目(31871748);国家自然科学基金青年科学基金项目(31201293);河南省高等学校青年骨干教师培养计划项目(2019GGJS084);河南工业大学青年骨干教师培育计划项
8、目(21420064);郑州市科技协同创新专项(21ZZXTCX17);中国博士后科学基金面上项目(2021M701112);河南工业大学创新基金支持计划专项(2021ZKCJ03)第一作者简介:邢玉飞(1998)(ORCID:0000-0002-8591-2863),女,硕士,研究方向为蛋白质资源开发及利用。E-mail:*通信作者简介:布冠好(1980)(ORCID:0000-0001-5867-986X),女,教授,博士,研究方向为蛋白质资源开发及利用。E-mail:大豆中含有丰富的蛋白质及多种人体必需氨基酸,是一种重要的植物性蛋白资源,常被加工成各种食品,如酱油、豆豉和豆浆等1。同时,
9、大豆还可以作为保健品 及医药制品的原料2。然而,大豆在部分国家是优先过敏原3。据统计,大豆过敏影响了大约0.2%0.4%的人群4-5,其在儿童中的过敏率高达13%6。随着植物基食品种类262 2023,Vol.44,No.15 食品科学 专题论述及大豆副产品的逐渐增加,大豆过敏的发病率也在不断上升7。据相关报道,引发大豆过敏反应的阈值水平在0.001 3500 mg8。现阶段,食物过敏是第四大公共卫生问题8-9,而大豆过敏是一种重要的食物过敏反应。食物过敏大多是由免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E介导的速发型过敏反应,当过敏性人群二次接触过敏原时,会刺激人体产生一系列免疫性反应
10、,其机理为过敏原特异性IgE与肥大细胞表面上的高亲和力IgE受体(receptor I for the Fc fragment of IgE,FcRI)相交联10,使细胞内已有的或新合成的白细胞介素(interleukin,IL)-3、IL-5、IL-13等细胞因子释放,并通过刺激嗜碱性粒细胞等其他炎症细胞激发过敏反应。由此引发皮肤、呼吸道及消化道症状,如皮疹、荨麻疹、哮喘、腹泻、腹痛等11,严重时可导致过敏性休克12。由于食品工业的高速发展及食品加工程度的不断深化,食物中的组分越来越复杂,其中微量过敏原成分的存在使得食物过敏的发生率不断增加。食物过敏主要发生在工业化国家13,多数工业化国家均
11、强制性要求商家将大豆、花生、牛奶、鸡蛋等主要食品过敏原在食品标签中有所显示14。目前,除对麸质的含量进行规范外,大多数过敏原的标识仅存在于定性阶段,即标明了“含有”或者“可能含有”15。当前,由于缺少对食品过敏的有效治疗手段,所以敏感人群要严格避免摄入含有一种或多种过敏原的食物。然而,大豆及其副产品广泛添加于许多素食和肉类食品中,通过饮食避免食物过敏变得较为困难。因此,对于大豆致敏蛋白特性的深入了解及研究快速、精确和标准化的过敏原检测方法具有重要的实际意义。1 大豆主要致敏蛋白及结构特性根据超速离心分类法,大豆蛋白可分为4 种主要蛋白质,分别为2S、7S、11S及15S球蛋白组分15。大豆中已
12、有38 种过敏原被识别16-18,根据致敏蛋白的组分含量及其致敏能力的差异,-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K被列为主要致敏成分19。1.1-伴大豆球蛋白-伴大豆球蛋白属于贮藏蛋白,其含量约占大豆总蛋白的30%20,分子质量约为210 ku,属于7S球蛋白。由(71 ku)、(67 ku)和(50 ku)3 种亚基通过疏水相互作用及静电相互作用连接形成三聚体糖蛋白21。亚基和由延伸区和核心区组成,其延伸区的氨基酸数量分别为125及141。而亚基仅有一个核心 区15,22,其氨基酸数量为418。3 种亚基随机组合形成3 种同三聚体(如3、3、3)和7
13、种异三聚体(如2、2、2、2、2、2、2),其中3的立体图如图1所示23。研究发现这3 种亚基都有不同程度的致敏性,其中-伴大豆球蛋白的亚基能被23%的患者血清识别,并且这3 种亚基之间具有较高的同源性24。其中,对于核心区,与的同源性为90.4%,与的同源性为76.2%,与的同源性为75.5%16-17;而和之间的延伸区具有57.3%的序列同一性25。ABA.俯视图;B.侧视图(90);图2同。图 1-伴大豆球蛋白3的透视图23 Fig.1 Ribbon diagrams of-conglycinin 3231.2 大豆球蛋白大豆球蛋白也是一种贮藏蛋白,约占大豆总蛋白含量的19.5%23.1
14、%18-19,其分子质量约为360 ku,属于11S球蛋白。大豆球蛋白由氢键连接的5 个主要亚基对组成,其主要亚基对根据氨基酸序列可以分为两组(组1包括A1aB1b、A1bB2、A2B1a;组2包括A3B4、A5A4B3)26,每个亚基对的分子质量约60 ku。目前已知的大豆球蛋白酸性多肽链有6 种:A1a、A1b、A2、A3、A4和A5,其分子质量为3540 ku;碱性多肽链有5种:B1a、B1b、B2、B3和B4,其分子质量均为22 ku。除了A5A4B3以外,其他亚基对均由1 个酸性A肽链和1 个碱性B肽链通过二硫键组成A-S-S-B单体形式27。研究表明,酸性多肽链与碱性多肽链的结合并
15、不是随机的,而是形成独特的酸性-碱性对28。Badley等29利用电子显微镜和X射线散射技术,首次揭示了大豆球蛋白的四级结构,阐明大豆球蛋白的物理形状是一个低扁圆柱体,其尺寸为11.0 nm11.0 nm7.5 nm,其中两个三聚体位于另一个三聚体之上,从而形成大豆球蛋白六聚体。同时两个三聚体通过静电作用相互连接,而三聚体中的亚单元则主要通过疏水力结合。迄今为止,仅有含A3B4亚单位的大豆球蛋白同型六聚体被确定了晶体结构,如图2所示30。在不同的离子强度、pH环境及热处理条件下,大豆球蛋白可被解离为亚基、成分多肽和半分子形式,但是天然状态下大豆球蛋白的分子结构十分紧密,一般难以被酶解和催化31
16、。针对致敏性而言,大豆球蛋白的致敏性弱于-伴大豆球蛋白24-25,其中大豆球蛋白碱性多肽链的致敏性较弱,而酸性多肽链的致敏性较强,原因是酸性多肽链与IgE、IgM、IgA有较强的结合活性。专题论述 食品科学 2023,Vol.44,No.15 263B1A1A2B3A3B2200178921083212517493AB图 2 大豆球蛋白A3B4的透视图30 Fig.2 Ribbon diagrams of glycinin A3B4301.3 Gly m Bd 30KGly m Bd 30K,又称P34,是一种半胱氨酸蛋白酶,广泛存在于大豆细胞液泡中32。Gly m Bd 30K是单体蛋白,其
17、氨基酸数量为379 个,分子质量为34 ku,属于7S球蛋白,约占大豆总蛋白含量的1%18,其结构如图3所示33。研究发现,66.5%的大豆过敏患者对Gly m Bd 30K识别并产生过敏反应,因此认为其属于大豆中的主要致敏蛋白19,34。同时,Gly m Bd 30K是一种糖蛋白,其N端170位氨基酸处是一个多糖链结合位点。研究表明,蛋白质的糖基化位置在其致敏性方面发挥重要作用35-36,因此Gly m Bd 30K存在一定致敏性。图 3 Gly m Bd 30K的透视图33Fig.3 Ribbon diagram of Gly m Bd 30K331.4 Gly m Bd 28KGly m
18、 Bd 28 K是由473 个氨基酸残基组成的糖蛋白27-28,其分子质量为26 ku,等电点为6.1,主要存在于7S球蛋白中,约占大豆总蛋白含量的0.5%37,其蛋白结构如图4 所示38。23%的大豆过敏患者可以对Gly m Bd 28K产生过敏反应34,其致敏表位最主要反映在其N端氨基酸序列:FHDDEGGDKKSPKSLFLMSSTR19,38,其多糖结合位点位于多肽链20位天冬酰胺处,该多糖由甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、木糖及海藻糖以物质的量比3 2 1 1组成39。研究表明,去糖基化后Gly m Bd 28K的致敏性完全消失18。图 4 Gly m Bd 28K的透视图38Fig.4
19、 Ribbon diagram of Gly m Bd 28K382 检测技术根据识别物质的不同,目前食品过敏原的检测技术可分为基于蛋白水平和基于核酸水平的检测技术。基于蛋白质水平的检测技术包括酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印迹法(Western blotting)、免疫层析法、质谱法及生物传感器法;基于核酸水平的检测技术有实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal
20、amplification,LAMP)技术。本文主要介绍当前大豆过敏原检测方法的基本原理、优缺点及实际应用,为后续研究提供依据。2.1 基于蛋白水平的检测技术2.1.1 ELISAELISA基于抗原-抗体的特异性结合对过敏原进行免疫测定,通过间接指标对过敏原含量进行定性或定量检测,不需要复杂或昂贵的设备40。ELISA作为常见的免疫学检测技术,已广泛应用于大豆中主要抗原蛋白的检测41。ELISA根据固定抗原方法的不同,可分为直接法和间接法,其中间接法包括夹心法及竞争法,不同ELISA方法的原理示意图如图5所示。Xi Jun等42建立了一种基于自制的重组蛋白Gly m Bd 28K及单克隆抗体的
21、竞争性ELISA法测定食品样品中的Gly m Bd 28K,其检测限为0.235 g/L,平均回收率为96.73%。Ma Xi等43基于自制的单克隆抗体4B2,建立了竞争性ELISA法检测大豆球蛋白,其检测限为0.3 ng/mL,定量线性范围为0.311.2 ng/mL。Segura-Gil等44开发出可检测-伴大豆球蛋白的两种检测方法,结果显示间接竞争ELISA法及夹心ELISA法的检测限分别为30 ng/mL及0.90 ng/mL,定量线性范围分别为103 000 ng/mL及215 ng/mL。Smirnova等45建立了检测食品中大豆原料的竞争性ELISA法,以大豆胰蛋白酶抑制剂为识别
22、物质,该方法的检测时长为60 min,检测限为3.5 ng/mL,定量线性范围为264 2023,Vol.44,No.15 食品科学 专题论述7.7110 ng/mL,研究结果证明该方法可用于检测肉类食品中的大豆过敏成分。夹心ELISA法检测灵敏度明显高于竞争性ELISA法,但更适合于未加工大豆蛋白的检测,而竞争性ELISA法则更适合检测加工后的大豆制品46。基于单克隆抗体所建立的ELISA法检测精准度高于基于多克隆抗体的ELISA法47。ABCDE?/?A.直接ELISA法;B.间接ELISA法;C.夹心式ELISA法;D.含标记抗体的竞争性ELISA法;E.含标记抗原的竞争性ELISA法。
23、图 5 ELISA的检测原理Fig.5 Principle of enzyme-linked immunosorbent assay2.1.2 免疫印迹法免疫印迹法又称蛋白质印迹法,是基于抗体的特异性来鉴定抗原的有效检测方法。首先进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),随后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质样品电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上。利用一抗作为“探针”,用标记的二抗进行“显色”,对样品进行检测与分析48,
24、免疫印迹法的具体步骤及原理如图6所示。Matsuo等49基于免疫印迹法,以IgE结合能力为指标,对比了转基因大豆及非转基因大豆的过敏原性,结果显示这两种大豆之间并无致敏性差异。免疫印迹法兼具电泳的高分辨力及免疫测定法的高特异性及敏感性等优点,可用于抗原的定性和半定量检测50。相比于ELISA,免疫印迹法的灵敏度较低,对检测样品中的大豆过敏原仅能进行定性或半定量检测,但是其可以追踪不同食物加工阶段产物中所有蛋白和肽段图谱。此外,免疫印迹法可以有效避免由于蛋白抑制剂的存在导致的检测结果假阴性现象50。1.SDS-PAGE2.?3.?6.?5.?4.?Western blotPAGE148 kDa9
25、8 kDa64 kDa52 kDa45 kDa36 kDa22 kDa?_?图 6 免疫印迹法的检测原理Fig.6 Principle of Western blotting2.1.3 免疫层析法免疫层析法基于抗原-抗体的特异性结合,首先将抗体预包被于硝化纤维素(nitrocellulose,NC)膜上,待测样品通过毛细作用涌动到预包被抗体区域时被捕获,使用酶标或胶体金作为检测标志物,从而得到可视化结果,以纤维素膜上显色条带及其颜色的深浅等作为评价指标,从而实现过敏原的定性或定量检测48,检测原理如图7所示。Wang Yao等51建立了胶体金标记的试纸条并应用于奶粉中大豆球蛋白的检测,利用自制
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