雌激素受体α下调导致小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤的作用机制.pdf
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1、网络出版时间:网络出版地址:生殖药理学雌激素受体 下调导致小鼠睾丸 支持细胞连接功能损伤的作用机制杨焱娜,张长城,常言语,周本文,陈思敏,邓何,赵海霞,(三峡大学 国家中医药管理局中药药理科研三级实验室、基础医学院、健康医学院,湖北 宜昌 )收稿日期:,修回日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目(,)作者简介:杨焱娜(),女,硕士生,研究方向:机体衰老的生理病理机制与药物防治机制;:;赵海霞(),女,博士,副教授,硕士研究生导师;研究方向:生殖衰老的发生机制与中医药防治机制;:文献标志码:文章编号:()中国图书分类号:;摘要目的探究雌激素受体 (,)下调导致的小鼠睾丸 支持细胞连接功能损伤是
2、否与自噬相关。方法不同浓度 抑制剂 ()处理 细胞,法检测细胞增殖活性;将细胞分为正常对照组、不同浓度 处理组。光镜观察细胞数量及形态变化;法检测 蛋白、连接功能相关蛋白、自噬标志物蛋白表达变化;免疫荧光法检测缝隙连接蛋白 ()表达与定位;氯喹(,)与 联合作用细胞 ,法检测自噬及连接功能相关蛋白表达水平。结果 及以上浓度时,细胞活力明显下降;光镜观察 组细胞空泡增多;与正常对照组相比,用药组 、闭锁小带蛋白 ()、闭锁蛋白()、紧密连接蛋白 ()、联蛋白()及 表达水平均下降,而神经钙黏蛋白()、上皮钙黏蛋白()表达无明显变化;微管相关蛋白轻链 ()上升,表达下降;免疫荧光结果显示,用药组
3、荧光表达量明显下降,位置无明显变化;与 组相比,组 、表达水平均上升。结论 下调可导致 细胞连接功能损伤,其机制可能与激活自噬有关。关键词:雌激素受体 ;支持细胞;细胞;自噬;连接功能;血睾屏障开放科学(资源服务)标识码():睾丸支持细胞通过与邻近的细胞形成紧密连接、缝隙连接、黏附连接维持睾丸血睾屏障(,)结构和功能的完整性,从而在精子发生过程中起着关键调节作用 。已有研究表明,损伤支持细胞的连接功能可导致 结构受损,进而阻碍精子发生,严重影响雄性生殖功能 。雌激素受体 (,)是经典的核雌激素受体,参与调节支持细胞连接功能 。课题组前期研究显示,自然衰老大鼠睾丸支持细胞 表达下降,而上调支持细
4、胞中 水平则可减轻衰老睾丸支持细胞分泌功能从而延缓衰老相关生精功能减退 。在十溴联苯醚诱导大鼠及原代支持细胞连接功能损伤模型中发现,支持细胞 蛋白表达明显减少,而 激动剂可恢复该毒物导致的闭锁小带蛋白 ()、闭锁蛋白()蛋白表达下调及 相关蛋白错误定位 。然而,影响支持细胞连接功能的具体作用机制目前未见报道。因此,本研究旨在明确 表达下调对支持细胞连接功能的影响基础上,进一步揭示其可能的分子机制。自噬是细胞调控自身稳态的一种重要机制,与支持细胞的功能维持密切相关,而自噬的过度激活可干扰细胞正常的蛋白质代谢,造成支持细胞连接功能损伤 。据报道,玉米赤霉烯酮诱导 细胞内自噬,下调连接功能相关蛋白
5、、紧密连接蛋白 ()和缝隙连接蛋白 ()蛋白表达,的完整性受损 ;慢病毒转染抑制多聚嘧啶束结合蛋白 的表达后致使小鼠原代支持细胞及 细胞间紧密连接缺失,损伤 的完整性,其机制与激活自噬有关 。对自噬的调节作用在多个领域已有研究报道。前列腺基质细胞 被阻断可诱导细胞自噬水平增加,细胞增殖抑制 。雌激素缺乏导致大鼠海马细胞 下降,可激活细胞自噬,促进海马细胞凋亡,进而导致学习记忆障碍 。然而 调节支持细胞连接功能是否中国药理学通报 ;():与自噬有关,目前未有文献报道。因此,本 实 验 拟 采 用 雌 激 素 受 体 抑 制 剂 ()抑制 细胞中 的表达,检测 表达下调对支持细胞连接功能的影响,并
6、从自噬角度探讨其损伤机制,为研究 在男性生殖功能中的作用及机制提供理论依据。材料与方法 材料 细胞小鼠睾丸支持细胞 细胞株购买于 细胞库。试剂 ()购自美国 公司;氯喹(,)()购自于美国 公司;()购自武汉科瑞生物技术有限公司;()购自美国 公司;胰蛋白酶()购自杭州吉诺生物医药技术有限公司;胎牛血清()购自德国 公司;裂解液()购自 公司;试剂盒()购自 北 京 普 利 莱 基 因 技 术 有 限 公 司;显 影 液()、多聚甲醛()均购自武汉塞维尔生物科技有限公司;抗体()购自美国 公司;抗体()、抗体()、抗体()均购自美国 公司;抗体()购自美国 公司;抗体()、抗体()均购自美国
7、公司;抗体()、抗体()购自万类生物科技有限公司;抗体()购 自 公 司;抗 体()购自美国 公司;购自美国 公司;()()购自 公司;()()购自武汉科瑞生物有限公司。方法 母液()配制称取 粉末溶于 细胞级 中,涡旋使其完全溶解。置于 保存;母液()配制:称取 粉末溶于 无菌 中,涡旋使其完全溶解。置于 避光保存。细 胞 培 养 使 用 含 胎 牛 血 清 的 培养基复苏 细胞,将细胞置于 、恒温培养箱中培养,待细胞生长密度达到 时,将细胞以?接种至新鲜培养基中传代培养,选择处于对数生长期且状态良好的细胞用于后期实验。检测指标 法检测 细胞活力 细胞制成密度为 细胞悬液,将其接种至 孔板中
8、,置于 的恒温培养箱中培养 。弃去培养基后每孔加入 不同浓度 的新鲜培养基继续作用 。弃去培养基加入 含 的新鲜培养基,避光孵育 ,取出 孔板震荡混匀 ,使用酶标仪在 波长处测量吸光度,计算各组细胞活力。光镜观察 细胞形态和密度变化制备密度为 的 细胞悬液,将其接种至 孔板中,次日观察细胞密度长至 ,不同浓度 处理 后,于光学显微镜下观察各组细胞形态及密度变化。法检测蛋白表达水平按上述步骤处理细胞,药物作用 ,弃去培养基,清洗两遍。每孔加入 裂解液,摇床裂解 ,用细胞刮将细胞刮取并收集至提前标好的 管中,冰上静置 ,涡旋震荡 ,重复 次。以、离心 ,收集上清获得总蛋白。法测量蛋白浓度,将蛋白与
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