UPLC-MS_MS法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究.pdf
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1、 南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:徐一丹硕士研究生通信作者:余祖功教授主要从事新兽药药理研究及兽药新制剂的研发:.徐一丹郭凡溪刘利锋等./法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究.南京农业大学学报():./.():./法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究徐一丹郭凡溪刘利锋张冯奕驰王俊丽邹远鹏余元倩余祖功(.南京农业大学动物医学院江苏 南京.南京朗博特动物药业有限公司江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在建立检测犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片的/方法并进行犬口服国产阿莫西林克拉维酸钾片与参比制剂的生物等效性评价 方方
2、法法 以乙腈和甲酸水溶液为流动相经 色谱柱梯度洗脱阿莫西林和克拉维酸分别用电喷雾正、负离子模式进行多反应监测()血浆样品用乙腈沉淀蛋白、二氯甲烷萃取对于克拉维酸血浆样品的预处理增加正己烷除脂的步骤经方法学验证后分别检测血浆样品中阿莫西林与克拉维酸浓度 生物等效性试验采用单剂量、双处理、双周期随机交叉试验设计选用 只健康成年比格犬按顺序分别空腹口服参比制剂或受试制剂 再用建立的/法检测血浆中阿莫西林和克拉维酸的浓度采用 .药动学软件的非房室模型计算药物的药动学参数对、和 进行对数转换后分析药物生物等效性 结结果果 该方法专属性良好阿莫西林在 、克拉维酸在 浓度范围内的信号响应值与浓度线性关系良好
3、(.)批内、批间准确度偏差均在以内批内、批间精密度均在 以内基质效应符合要求阿莫西林和克拉维酸在试验条件下稳定 参比制剂和受试制剂中:阿莫西林的 分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)克拉维酸的 分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)分别为(.)和(.)、经对数转换后几何均值比的 置信区间均落在.经非参数检验无明显差异 结结论论 所建/方法符合生物样品分析要求国产阿莫西林克拉维酸钾片与参比制剂在犬体内生物等效关键词:阿莫西林克拉维酸/犬生物等效性中图分类号:.文献标志码:文章编号:()/(.):/.().第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性
4、研究 ./.(.).(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)./.:/阿莫西林属半合成广谱青霉素类抗生素化学名称为()二甲基()()氨基(羟基苯基)乙酰氨基氧代硫杂氮杂双环.庚烷甲酸三水合物通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥杀菌作用 它对金葡菌、链球菌、棒状杆菌等革兰阳性菌以及大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等革兰阴性菌均有较强作用 阿莫西林耐胃酸但不耐 内酰胺酶易被 内酰胺酶水解破坏 克拉维酸是一种 内酰胺酶抑制剂化学名称为()(羟基亚乙基)氧代氧杂氮杂双环.庚烷羧酸仅有微弱的抗菌活性不单独用于抗菌治疗通常与阿莫西林等内酰胺抗生素合用以克服细菌的耐药性 阿莫西林克拉维
5、酸钾片在宠物临床应用于敏感菌所致的各种感染如皮肤及软组织感染、尿道感染、呼吸道感染等 农业农村部已将宠物用阿莫西林克拉维酸钾片列入兽药比对试验目录(第一批)近年来宠物医疗行业在我国发展迅猛国内宠物用阿莫西林克拉维酸钾制剂生产企业稀少应用前景广阔 本研究首先建立犬血浆中阿莫西林和克拉维酸浓度的/检测方法并应用该方法开展国产阿莫西林克拉维酸钾片与进口产品(参比制剂)在犬体内的生物等效性试验为国内宠物制药企业生产的阿莫西林克拉维酸钾片的申请上市提供技术支持 材料与方法.药品与试剂阿莫西林对照品中国食品药品鉴定研究所批号 纯度.克拉维酸标准品中国食品药品鉴定研究所批号 纯度.阿莫西林 标准品(阿莫西林
6、的内标):批号化学纯度.同位素纯度.阿莫西林克拉维酸片参比制剂意大利豪普特制药厂批号 规格为 阿莫西林克拉维酸片受试制剂南京朗博特动物药业有限公司批号 规格为 超纯水由 公司生产的 型水纯化系统制备甲醇和乙腈德国 公司色谱级甲酸美国 公司质谱级二氯甲烷、正己烷、乙酸铵、冰醋酸均为分析纯级试剂.仪器设备 系统超高效液相色谱仪(美国 公司)型三重四极杆串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国 公司)型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)型和 型低温高速离心机(德国 公司)型水纯化系统(美国 公司)型涡旋混合仪(上海驰唐电子有限公司)型超声波清洗仪(美国南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 公司)型振荡器(
7、公司)型冰箱(海尔集团)型超低温冰箱(赛默飞世尔仪器有限公司).实验动物 只成年健康比格犬雌雄各半体重为(.)来源于江苏亚东实验动物研究中心 将实验犬饲养于南京农业大学实验动物中心普通动物房内饲喂不含任何抗菌药物的实验犬维持饲料试验前进行 的适应性饲养和观察.相关溶液的制备.对照品储备液 阿莫西林储备液:精确称量阿莫西林对照品置于 量瓶用 甲醇水溶解并稀释至刻度摇匀制成 的储备液 克拉维酸储备液:精确称量克拉维酸对照品置于 量瓶用 乙腈水超声溶解并稀释至刻度摇匀制成 的储备液 对照品储备液平行制备 份分别用于标准曲线和质控样品的制备 阿莫西林 储备液:精确量取 甲醇水 溶解阿莫西林()后将全部
8、溶液转移至 容量瓶中用 甲醇水稀释至刻度摇匀即得内标储备液 储备液均置于 冷冻保存.系列工作液 用超纯水精确稀释阿莫西林储备液制成.、的阿莫西林系列标准曲线工作液和.、.、的阿莫西林质控工作液用超纯水精确稀释克拉维酸储备液制成、的克拉维酸系列标准曲线工作液和、的克拉维酸质控工作液 精确量取内标储备液适量用超纯水稀释 倍即得 内标工作液 工作液于 保存备用./测定方法.色谱条件 色谱柱为 (.)流速.进样量 柱温 阿莫西林:进样室温度 流动相 为乙腈流动相 为体积分数.的甲酸水溶液 洗脱程序:.克拉维酸:进样室温度 流动相 为乙腈流动相 为体积分数.的甲酸水溶液 梯度洗脱程序:.质谱条件 采用电
9、喷雾离子源使分析物离子化并在多反应监测()模式下分别对阿莫西林及内标进行正离子()监测对克拉维酸及内标进行负离子()监测 阿莫西林:毛细管电压.离子源温度 脱溶剂温度 脱溶剂气流速 锥孔气流速 克拉维酸:毛细管电压.离子源温度 脱溶剂温度 脱溶剂气流速 锥孔气流速 各化合物的定量定性离子对、锥孔电压和碰撞能见表 表 阿莫西林、克拉维酸和内标的质谱参数 监测模式 分析物离子对/锥孔电压/碰撞能量/阿莫西林.阿莫西林.克拉维酸 注:此离子对用于定量分析 .血浆样品预处理.阿莫西林血样预处理)取血浆样品 精确加入内标工作液 涡旋 加入醋酸铵缓冲液(.)和乙腈 涡旋 振荡 、离心 )取上清液.加入二氯
10、甲烷 涡旋 、离心)取上层水相 加超纯水 涡旋混匀.滤头过滤后进样分析.克拉维酸血样预处理)取血浆样品 加入 乙腈涡旋 、离心 )转移上清液置干净的离心管中加入二氯甲烷 涡旋 、离心 第 期徐一丹等:/法测定犬血浆中阿莫西林和克拉维酸片剂的生物等效性研究)取上层液体加入正己烷 涡旋 、离心 )取下层水相.滤头过滤后进样分析.方法学验证.专属性 阿莫西林:取 只不同犬的空白血浆样品、空白血浆加 阿莫西林标准溶液空白血浆加 克拉维酸标准溶液空白血浆加内标工作液按.节方法处理样品后检测克拉维酸:取 只不同犬的空白血浆样品、空白血浆加 阿莫西林标准溶液空白血浆加 克拉维酸标准溶液按.节方法处理样品后检
11、测.标准曲线及线性分析 取空白血浆 分别加入相应浓度的阿莫西林系列标准工作液 制成、的阿莫西林标准曲线血浆样品取空白血浆 分别加入相应浓度的克拉维酸系列标准工作液 制成、和 的克拉维酸标准曲线血浆样品 按.节方法处理后进样检测以阿莫西林浓度()为横坐标峰面积比值()为纵坐标绘制阿莫西林标准曲线 以克拉维酸样品浓度()为横坐标克拉维酸峰面积()为纵坐标绘制克拉维酸标准曲线 种分析物标准曲线计算均采用加权(/)最小二乘法线性回归分析.准确度和精密度 取空白血浆 分别加入相应浓度的阿莫西林质控工作液 制备阿莫西林质量浓度为、的质控样品取空白血浆 分别加入相应浓度的克拉维酸质控工作液 制备克拉维酸质量
12、浓度为、的质控样品 每个浓度 个平行样品连续制备并测定 个分析批根据当日的标准曲线方程求得质控样品浓度计算准确度、批内()及批间()精密度.基质效应 空白基质加标样品制备:取 只不同犬的空白血浆用乙腈沉淀蛋白并涡旋离心后取全部上清液分别加入低、高浓度质控工作液(阿莫西林样品加内标工作液)再按.节方法继续处理每个浓度 个平行样品 纯溶液样品制备:以超纯水替换空白血浆其余步骤相同 记录检测空白基质加标样品的阿莫西林峰面积为 内标峰面积为 检测纯溶液样品的阿莫西林峰面积平均值为 内标峰面积平均值为 计算经内标归一化的基质因子(/)/(/)及其精密度 记录检测空白基质加标样品的克拉维酸峰面积为 纯溶液
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