VEGF_VEGFR2通路在牙髓血运重建术模型大鼠牙髓血管新生中的作用.pdf
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1、2014;12:130郾21摇 Fahnestock M,Shekari A郾 ProNGF and neurodegeneration in Alzhei鄄mer忆s disease也J页.Front Neurosci,2019;13:129郾22摇 Cao JY,Lin Y,Han YF,et al.Expression of nerve growth factor car鄄ried by pseudotyped lentivirus improves neuron survival and cogni鄄tive functional recovery of post鄄ischemia i
2、n rats也J页.CNS NeurosciTher,2018;24(6):508鄄18.也2022鄄07鄄10 修回页(编辑摇 李和旭)VEGF/VEGFR2 通路在牙髓血运重建术模型大鼠牙髓血管新生中的作用王芹摇 李立恒摇 王钟华摇(河北北方学院附属第一医院口腔科,河北摇 张家口摇 075000)摇 摇 也摘摇 要页摇 目的摇 探究血管内皮生长因子(VEGF)/VEGF 受体(VEGFR)2 在牙髓血运重建术(REPs)中的表达变化,揭示其调控牙髓血管新生的机制。方法摇 取雄性 SD 大鼠 25 只,随机分为正常对照组、根尖周炎组、REPs 术后 7、14、28 d 组,每组 5 只;正常
3、对照组不做任何处理,根尖周炎组于左右两侧下颌第一磨牙处行牙髓摘除术,REPs 术后 7、14、28 d 组在根尖周炎组基础上行 REPs。苏木素鄄伊红(HE)染色观察左侧牙根尖及牙周组织形态变化;免疫组化染色法检测左侧牙根尖及牙周组织 VEGF 阳性表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测右侧牙根尖周组织肿瘤坏死因子(TNF)鄄琢、白细胞介素(IL)鄄1茁 水平;以 Western 印迹检测右侧牙根尖周组织 VEGFR2、骨桥蛋白(OPN)、整合素(琢v)茁3 蛋白表达。结果摇 与正常组相比,根尖周炎组可见牙根管壁薄、根尖孔呈开放状态、根管内坏死物质较多、根尖周炎性细胞浸润等病理现象,根尖
4、周组织 TNF鄄琢 及IL鄄1茁 水平、VEGF 阳性表达水平、VEGFR2 蛋白表达均显著升高,OPN、琢v茁3 蛋白表达均显著降低(均 P0郾 05);与根尖周炎组相比,REPs 术后 7、14、28 d 组根管壁逐渐增厚、根尖孔逐渐闭合,根管内矿化基质、致密结缔组织逐渐生成,根尖周围骨细胞沉积逐渐明显,根尖周组织 VEGF 阳性表达水平、VEGFR2、OPN、琢v茁3 蛋白表达显著均增高,TNF鄄琢 及 IL鄄1茁 水平显著均降低(均 P0郾 05)。结论摇 REPs 术可通过激活 VEGF/VEGFR2 通路,上调 OPN、琢v茁3 蛋白表达,促进牙根生长及牙髓再生。也关键词页摇 血管
5、内皮生长因子(VEGF);VEGF 受体(VEGFR)2;牙髓血运重建术;牙髓血管新生;牙周炎也中图分类号页摇 R781摇 也文献标识码页摇 A摇 也文章编号页摇 1005鄄9202(2023)17鄄4246鄄05;doi:10郾 3969/j郾 issn郾 1005鄄9202郾 2023郾 17郾 041基金项目:2021 年度河北省医学科学研究课题计划(20210456)第一作者:王芹(1984鄄),女,硕士,主治医师,主要从事口腔疾病治疗研究。摇 摇 牙髓血运重建术(REPs)为治疗年轻恒牙根尖周病的新方法,该术可刺激根尖周损伤并诱导血液进入根管,促进牙根继续发育也1页。近年来,因龋齿或
6、者外伤等原因导致的年轻恒牙牙髓病和根尖周病的发病率逐年上升,REPs 诱导血管新生、促进牙髓修复再生、治疗牙髓病和根尖周病的潜在作用越来越受到临床研究的重视也2页。但 REPs 在细胞因子水平的研究少见,其促进牙髓血管再生修复的具体分子生物学机制也不甚明确。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种促血管生成最强烈的细胞因子,可与 VEGF 受体(VEGFR)2 结合调控相关基因转录表达,参与炎症反应、创伤愈合及组织器官生长发育等过程也3页。但 VEGF/VEG鄄FR2 是否参与调控牙髓血管再生促进牙髓组织修复过程还不明确。本研究通过在根管显微镜下建立大 鼠 磨 牙 牙 髓 血 管 再 生 术 动
7、 物 模 型,探 讨VEGF/VEGFR2 的动态表达及定位情况,推测其在牙髓血管再生术后修复中的价值。1摇 材料与方法1郾 1摇 动物摇取雄性 SD 大鼠 25 只,体质量 250 280 g,鼠龄 2 3 个月,口腔卫生状况良好,无龋齿及牙周疾病,动物合格证号为 SCXK(渝)2017鄄006。饲养于河北北方学院附属第一医院动物房内。本研究由河北北方学院附属第一医院动物伦理委员审核批准也审批号:IACUC鄄01(20160917)页。1郾 2 摇主 要 试 剂 与 仪 器 摇胰 蛋 白 酶 也 货 号:abs47047375,爱必信(上海)生物科技有限公司页;苏木素鄄伊红(HE)染色试剂盒
8、(货号:R20570,厂家:上海 源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司);VEGF(货 号:ab69479)、VEGFR(货 号:ab39638)、骨 桥 蛋 白(OPN,货 号:ab8448)、整 合 素(琢v)茁3(货 号:ab119365)抗体(美国 abcam 公司);蛋白电泳仪(型号 1658033,美国 Bio鄄Rad 公司)。1郾 3摇 模型构建与分组摇 随机将 25 只大鼠分为正常对照组、根尖周炎组、REPs 术后 7、14、28 d 组,根尖周炎模型建立及 REPs 参照文献也4页进行。将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后,仰卧固定,用 30 ml/L 的饱和过氧化氢液棉球清洁口腔,7
9、50 mg/L 乙醇消毒双侧磨牙区,取左右两侧下颌第一磨牙放置吸唾管,全程保6424中国老年学杂志 2023 年 9 月第 43 卷持无菌操作。在根管显微镜下用高速不锈钢 1/4 球钻从大鼠下颌第一磨牙的牙合面近中窝向下钻磨开髓,用#6、#8K 锉疏通根管,并去除根管内牙髓,生理盐水冲洗根管后取出 K 锉,建立根尖周炎模型。REPs:在第一磨牙开髓、去髓后,用生理盐水冲洗残留牙髓组织,再用针刺激根尖出血,棉球(无菌)轻压止血,待凝固后将血凝块表面用三氧化物多聚体(MTA)覆盖,并充填流动树脂;术后注意实验动物保暖,待其苏醒后,正常进水进食。正常对照组不做处理。正常对照组及根尖周组于术后 28
10、d 取材,REPs 各组于术后 7、14、28 d 取材进行实验。1郾 4摇 组织标本采集摇麻醉处死大鼠,分离下颌骨,取左侧下颌骨标本置于 4%多聚甲醛中固定 24 h。右侧下颌骨标本取牙根尖周组织,置于液氮中保存。1郾 5摇CT 影像学观察摇左侧下颌骨标本固定 24 h后置于专用扫描管中,将牙体长轴平行与管长轴放置,调 定 扫 描 电 压 为 70 kV,功 率 30 W,电 流429 滋A,用显微 CT 成像系统进行断层扫描 15 min获得断面成像,用于后续观察分析。1郾 6摇HE 染色观察大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周组织病理学变化摇 左侧下颌骨标本做完 CT 成像后,标本用 400 g
11、/L 甲酸脱钙处理(可针刺穿透),梯度乙醇脱水、石蜡包埋后,连续切 4 滋m 厚切片,行HE 染色,光学显微镜下观察组织病理形态学。1郾 7摇 免疫组化染色检测大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周组织 VEGF 表达摇取 1郾 6 中石蜡切片,烤箱烘烤2 h,常规脱蜡、水化、3%过氧化氢灭活、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复、5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭后,加入一抗 VEGF 抗体(1 颐500)孵育过夜,室温下与羊抗兔二抗(1 颐1 000)孵育 2 h 后,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染;封片后于光镜下观察并拍照,Image Pro Plus5郾 0 软件分析VEGF 阳性表达的平
12、均光密度值。1郾 8摇各组第一磨牙牙根尖周组织肿瘤坏死因子(TNF)鄄琢、白细胞介素(IL)鄄1茁 水平检测摇取 1郾 4中液氮中保存的部分牙根尖组织,4 益 下解冻后加生理盐水研磨制备组织匀浆液,离心取上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 TNF鄄琢、IL鄄1茁 水平。1郾 9摇Western 印迹检测牙根尖周组织 VEGFR2、OPN、琢v茁3 蛋白表达摇提取牙根尖组织总蛋白,测定蛋白浓度后,电泳分离 50 滋g 蛋白样品并转膜,室温下将膜封闭 2 h 后,4 益 冰箱中与一抗 VEGFR2(1 颐500)、OPN(1 颐500)、琢v茁3(1 颐500)、茁鄄肌动蛋白(actin,1
13、 颐2 000)孵育过夜,室温下与羊抗兔二抗(1 颐1 000)孵育2 h 后,增强化学发光法显影,Image J 软件分析蛋白表达量。1郾 10摇 统计学处理摇采用 SPSS22郾 0 软件进行单因素方差分析和 SNK鄄q 检验。2摇 结摇 果2郾 1摇 各组一般状况摇 各组试验期间均存活,试验牙周及根尖周外黏膜无明显红肿,牙体均无折裂或充填物脱落情况。2郾 2摇 各组牙根尖及牙根尖周组织 CT 影像学检查结果摇 正常对照组牙根发育完善,根尖孔闭合;根尖周炎组牙髓腔开放,根管壁薄,根尖孔未闭合呈开放状;REPs 术后 7 d 组牙髓腔较大,根管壁薄;REPs术后 14 d 组根管壁增粗,牙髓
14、腔缩窄,根尖稍膨大;REPs 术后 28 d 组,根管口闭合,管壁增厚,有新生高密度硬组织形成,见图 1。图 1摇 各组牙根尖及牙根尖周组织 CT 影像(伊100)2郾 3摇 各组牙根尖及牙根尖周组织形态变化摇正常对照组根管内可见疏松的结缔组织,根尖牙周膜区为致密结缔组织及大量的纤维、血管和细胞分布;根尖周炎组根管内含坏死物质,根尖周炎性细胞浸润明显,根管内未见新生组织形成;REPs 术后 7 d 组根管内有少量不规则矿化基质和致密结缔组织生成,根尖区周围聚集着少量炎症细胞和幼稚的成纤维细胞;REPs 术后 14 d 组根管内有大量不规则矿7424王芹等摇 VEGF/VEGFR2 通路在牙髓血
15、运重建术模型大鼠牙髓血管新生中的作用摇 第 17 期化基质和致密结缔组织生成,根尖区附近细胞有进入根管的趋势;REPs 术后 28 d 组根管内可见大量内含血管的新生结缔组织,根管壁增厚,根尖部膨大,根尖孔缩小,见图 2。2郾 4摇各组根尖周组织 VEGF 表达 摇深棕色为VEGF 强阳性表达。正常对照组 VEGF 在根尖周组织中呈弱阳性表达;根尖周炎组 VEGF 在根尖孔炎性细胞浸润区呈强阳性表达;REPs 术后 7 d 组VEGF 在根尖周增生的成纤维细胞中呈强阳性表达;REPs 术后 14 d 组及 28 d 组 VEGF 在根尖周骨组织骨细胞与吸收的陷窝内呈强阳性表达。见图 3。与正常
16、组对照相比,其他各组 VEGF 阳性表达均显著升高;与根尖周炎组相比,REPs 术后 7、14、28 d 组 VEGF 阳性表达均显著升高;与术后 7 d 组相比,REPs 术后 14、28 d 组,VEGF 阳性表达均显著升高(均 P0郾 05),见表 1。图 2摇 各组牙根尖及牙周膜组织(HE 染色,伊200)图 3摇 各组根尖周组织 VEGF 表达(免疫组化,伊400)2郾 5摇各组根尖周组织 TNF鄄琢、IL鄄1茁 水平摇与正常对照组相比,根尖周炎组 TNF鄄琢、IL鄄1茁 水平显著升高;与根尖周炎组相比,REPs 术后 7、14、28 d 组上述指标水平显著降低;与 REPs 术后
17、7 d 组相比,REPs 术后 14、28 d 组上述指标均显著降低;与REPs 术后 14 d 组相比,REPs 术后 28 d 组上述指标均显著降低(均 P0郾 05),见表 1。2郾 6摇 各组根尖周组织中 VEGFR2、OPN、琢v茁3 蛋白表达情况摇 与正常对照组相比,根尖周炎组根尖周组织 VEGFR2 蛋白表达显著升高,OPN、琢v茁3 蛋白表达均显著降低(均 P0郾 05);与根尖周炎组相比,REPs 术后 7、14、28 d 组 VEGFR2、OPN、琢v茁3 蛋白表达均显著增高;与 REPs 术后 7 d 组相比,REPs 术后 14、28 d 组上述指标均显著升高(均 P0
18、郾 05),见表 1、图 4。表 1摇 各组牙根尖及牙根尖周组织 VEGF、TNF鄄琢、IL鄄1茁、VEGFR2、OPN、琢v茁3 表达水平比较(n=5,x依s)组别VEGF(平均光密度值)TNF鄄琢(pg/ml)IL鄄1茁(pg/ml)VEGFR2OPN琢v茁3正常对照组0郾 29依0郾 0516郾 29依1郾 0220郾 29依1郾 020郾 21依0郾 121郾 13依0郾 121郾 05依0郾 11根尖周炎组1郾 01依0郾 201)99郾 31依4郾 211)98郾 31依4郾 011)0郾 51依0郾 151)0郾 32依0郾 131)0郾 68依0郾 121)REPs 术后 7
19、d 组1郾 73依0郾 191)2)79郾 73依3郾 181)2)73郾 73依3郾 081)2)0郾 93依0郾 131)2)1郾 54依0郾 151)2)1郾 36依0郾 151)2)REPs 术后 14 d 组2郾 46依0郾 211)2)3)52郾 26依3郾 201)2)3)49郾 26依2郾 691)2)3)1郾 56依0郾 141)2)3)1郾 97依0郾 121)2)3)1郾 83依0郾 151)2)3)REPs 术后 28 d 组2郾 25依0郾 141)2)3)32郾 25依2郾 121)2)3)4)30郾 25依2郾 021)2)3)4)1郾 51依0郾 121)2)3
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