RSPO2在两种绵羊皮肤中的差异表达及对毛囊生长相关基因表达的影响.pdf
《RSPO2在两种绵羊皮肤中的差异表达及对毛囊生长相关基因表达的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RSPO2在两种绵羊皮肤中的差异表达及对毛囊生长相关基因表达的影响.pdf(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、9-1183-10网络首发时间:2 0 2 3-0 6-0 82023,53(09):1183-1192中国兽医科学2023,53(09)ChineseVeterinaryScienceD0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0156中图分类号:S852.21文献标志码:A文章编号:16 7 3-46 96(2 0 2 3)0 9RSPO2在两种绵羊皮肤中的差异表达及对毛囊生长相关基因表达的影响王荣,吴晋强,董亚洁,郝晓静,耿建军,王海东,赫晓燕*(山西农业大学动物医学学院,山西晋中030801)摘要:为探究特异性顶部盘状底板反应蛋白2(RSPO2)在2 种绵羊皮
2、肤中的差异表达及其对毛囊生长相关基因表达的影响,以美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤为材料,利用免疫组织化学、实时荧光定量PCR技术和Western-blot技术检测RSPO2在美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤毛囊中的表达与定位;在皮肤成纤维细胞中过表达和干扰RSPO2,用实时荧光定量PCR和Western-blot检测毛囊生长相关基因及增殖相关基因的表达。结果显示,RSPO2mRNA和蛋白在美利奴羊和小尾寒羊中均有表达,且美利奴羊中的表达量极显著高于小尾寒羊(P0.01)。在成纤维细胞中转染过表达RSPO2载体后,-连环蛋白(-catenin)和LeflmRNA和蛋白的表达量极显著升高(P0.01),BM
3、P4和TGF-1mRNA和蛋白的表达量极显著降低(P0.01);在成纤维细胞中转染干扰RSPO2载体后,-catenin和LeflmRNA和蛋白的表达量极显著降低(P0.01),BMP4和TGF-B1mRNA和蛋白的表达量极显著升高(P0.01)。同时,试验证实RSPO2可以促进成纤维细胞的增殖。结果表明,RSPO2对绵羊毛囊生长有一定的作用,可能是通过促进成纤维细胞增殖和调控参与毛囊生长相关基因的表达来实现的。关键词:RSPO2;毛囊;生长;绵羊;成纤维细胞Differential expression of RSPO2 in the skin of two sheep and its ef
4、fecton expression of genes related to hair follicle growthWANG Rong,WU Jin-qiang,DONG Ya-jie,HAO Xiao-jing,GENG Jian-jun,WANG Hai-dong,HE Xiao-yan(College of Veterinary Medicine,Shanxi A gricultural University,Jinzhong 030801,China)Abstract:To investigate the differential expression of roof plate-sp
5、ecific spondin 2(RSP02)in theskin of two sheep breeds and its effect on genes related to hair follicle growth,the dorsal skin ofMerino sheep and Small Tail Han sheep were used as materials.The expression and localization of RSP02in back skin hair follicles of Merino sheep and Small Tail Han sheep we
6、re detected by immunohistoche-mistry,real-time quantitative PCR and Western-blot.RSPO2 was overexpressed and interfered in skin fi-broblasts,and the expressions of hair follicle growth-related genes and proliferation-related geneswere detected by real-time quantitative PCR and Western-blot.The resul
7、ts showed that RSPO2 mRNA andprotein were expressed in both Merino sheep and Small Tail Han sheep,and the expression was signifi-cantly higher in Merino sheep than Small Tail Han sheep(P0.01).The expression of-catenin and LeflmRNA and protein were highly significantly increased(P0.01)and the express
8、ion of BMP4 and TGF-1收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 3;修回日期:2 0 2 3-0 4-14基金项目:国家自然科学基金项目(317 7 2 6 90);山西省自然科学基金项目(2 0 17 0 1D121106);山西省现代农业产业技术体系建设专项(2 0 2 2-14)作者简介:王荣(1997-),女,山西吕梁人,硕士生,主要从事动物毛发生长调控分子机制的研究,E-mail:。*通讯作者:赫晓燕(196 3-),女,河南浚县人,教授,博士,主要从事动物毛发生长调控分子机制的研究,E-mail:。1184第53 卷中国兽医科学mRNA and protein we
9、re highly significantly decreased(P0.01)after transfection of overexpressionRSP02 vector in fibroblasts.After transfection of interference RSP02 vector in fibroblasts,the ex-pression of-catenin and Lefl mRNA and protein expression were significantly decreased(P0.01),while BMP4 and TGF-1 mRNA and pro
10、tein expression were significantly increased(P0.01).At the sametime,the test confirmed that RSP2 can promote the proliferation of fibroblasts.In conclusion,RSP02has a certain effect on sheep hair follicle growth,which may be achieved by promoting fibroblasts pro-liferation and regulating the express
11、ion of genes related to hair follicle growth.Key words:RSP02;hair follicle;growth;sheep;fibroblasts*Corresponding author:HE Xiao-yan,E-mail:*Corresponding author:HE Xiao-yan,E-mail:羊毛是纺织业的重要原料,羊毛品质和产量直接影响养羊业和毛纺工业的发展,决定羊毛品质的羊毛性状包括密度、长度、细度、强度和净毛率等 1。美利奴羊属于细毛型绵羊,毛细长且浓密、可作为毛纺织业的优质原料 2 。小尾寒羊产羔率高,但其毛密度相对稀
12、疏、产毛量低且属于劣质毛,毛细度及长度与美利奴羊相比较差 3-4。因此,提高羊毛产量和羊毛品质对养羊业经济发展尤为重要。哺乳动物毛发的生长受到毛囊器官的调控,毛囊主要由毛乳头、毛基质、内根鞘、外根鞘和连接组织鞘等构成 5。毛囊生长发育具有周期性,分为生长期、退行期和休止期3个阶段 6 。特异性顶部盘状底板反应蛋白(roofplate-speci-ficspondin,RSPO)家族是一种分泌蛋白,包含RSPO1、RSPO2、RSPO 3和RSPO47。据报道,RSPO2可以促进小鼠和羊驼毛发毛囊发育。然而,RSPO2在绵羊皮肤毛囊生长发育中的作用研究较少本研究选取美利奴羊和小尾寒羊的背部皮肤组
13、织为试验材料,通过免疫组织化学技术、实时荧光定量PCR技术、Western-blot技术对这2 种绵羊背部皮肤组织中RSPO2mRNA和蛋白水平表达情况进行分析。同时,以胎羊皮肤为试验材料培养皮肤成纤维细胞,利用细胞转染技术,过表达和干扰绵羊皮肤成纤维细胞中RSPO2的表达,初步探究RSPO2对毛囊生长相关基因表达的影响及其对成纤维细胞增殖的影响,为阐明绵羊毛发生长发育的调控机制提供一定的理论依据。1材料与方法1.1实验动物与试剂试验羊均选自山西某羊场具有相似饲养管理条件下,性别均为雌性、年龄均为3岁左右、体型相近且生长状况良好的美利奴羊和小尾寒羊各3只。试验所取组织为羊背部皮肤组织,采集后使
14、用PBS冲洗,1块用于组织包埋固定,1块放人液氮罐保存。RNAisoPlus(诺唯赞);RIPA组织/细胞裂解液、波形蛋白家兔单克隆抗体(VimentinRabbit Mono-clonalAntibody)、二基苯基吲哚(DAPI)(上海碧云天生物技术有限公司);SPRabbit&MouseHRPKit(DAB)试剂盒(康为世纪生物科技股份有限公司);0.2 5%胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS缓冲液、40g/L多聚甲醛、CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);RSPO2抗体(北京博奥森生物技术有限公司);质粒小提试剂盒(天根
15、生化科技有限公司);DMEM、Li p o f e c t a m i n 2 0 0 0(赛默飞世尔科技有限公司)。1.2免疫组织化学染色分析将固定好的皮肤组织进行修块、梯度乙醇脱水、二甲苯和无水乙醇(体积比为1:1)透明、浸蜡、包埋、切片,切片厚7 m。将制备好的石蜡切片按SPRabbit HRTKIT(DAB)试剂盒说明书进行试验。60烤片1h,脱蜡水化后进行抗原修复,切片滴加内源性过氧化物封闭液室温孵育10 min,PBS充分淋洗后滴加封闭用正常羊血清工作液室温孵育10min,甩干,滴加一抗工作液(RSPO2抗体1:2 0 0)4过夜孵育,滴加二抗工作液室温孵育10 min,PBS充分
16、淋洗后滴加HRP标记的链霉亲和素室温孵育10 min,PBS充分淋洗后滴加适量的显色工作液,经复染、脱水透明,封片。利用显微镜观察切片结果并选取3个不同视野拍照。使用ImageJ1.47软件进行光密度分析,使用GraphPadPrism8.3软件对数据进行差异分析。1.3实时荧光定量PCR从NCBI中选取目的基因RSPO2及内参基因的CDS区序列,利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物,并交由西安擎科生物科技有限公司合成,引物信息见表1。用TRIzol法提取RNA,再将得到的RNA用试剂盒反转录成cDNA。以18 SrRNA为内参基因,利用1185荣等:RSPO2在两种绵羊皮肤
17、中的差异表达及对毛囊生长相关基因表达的影响第9 期表1引物序列信息Table1Primer sequence information基因引物序列(5 3)产物大小/bpGenesPrimersequenceProductsizeF:TCGTCTCTTCTCCTTTGCCCRSPO291R:ACCAGCTCTCTTACTGCGTCF:GAAGGGCACCACCAGGAGT18S rRNA198R:CAGACAAATCACTCCACCAAF:GCTTCCTCTCCTATCACCGCCCND1182R:GTCCACCTCCTCCTCTTCCTF:TGGAGAACTTGGAAATGGAAPCNA153
18、R:GGAGACAGTGGAGTGGCTTTF:CAAGTGGGTGGCATAGAGG-catenin151R:CGTAGTGAAGGCGAACAGCF:ACTGGCATCCCTCATCCLef1116R:GGCTCCTGCTCCTTTCTF:AGGCTACCAGGCGTTCTACBMP4190R:AACCACCTTGTCATACTCATCCF:CGGAGTGGCTGTCCTTTGTGF-1146R:GGAACTGAACCCGTTGATGSYBRGreen实时荧光定量PCR试剂盒对RSPO2基因进行荧光定量PCR。反应总体系为10 L:2 ChamQ Universal SYBR qPCR M
19、aster Mix 5 L,上下游引物各0.4L,cDNA1L,ddHO3.2L。反应程序为:9 530 s;9510 s,6 0 30 s 40 个循环;95 15 s,6 0 1m i n,95 15 s。以18 S rRNA 作为内参基因,利用2-M4G法计算RSPO2mRNA在小尾寒羊和美利奴羊背部皮肤中的表达差异1.4Western-blot分析将液氮中保存的小尾寒羊和美利奴羊皮肤组织置于预冷的研钵中研磨成粉末,放人蛋白裂解液中混匀且冰上静置30 min充分裂解,412 0 0 0 g离心10 min后取上清并测定蛋白质量浓度。进行SDS-PAGE,利用转膜将目的蛋白转移至硝酸纤维素
20、(NC)膜上,置于封闭液中室温封闭1h,加一抗后4过夜孵育(RSPO21:800;-actin1:3000),用TB-ST洗3次,每次10 min,加二抗后37 摇床孵育1h(RSPO2抗体1:2 0 0 0 0;-actin1:2 0 0 0 0),同样用TBST洗6 次,每次5min,使用ECL发光液利用凝胶成像系统进行图像曝光采集。运用ImageJ1.47软件进行灰度值分析,使用GraphPadPrism8.3软件进行差异分析。1.5细胞培养及观察将从山西羊场取回的胎羊放置于灭菌生理盐水中浸没,使用眼科剪眼科镊将胎羊背部皮肤剥离,并尽可能地除去皮肤上多余的结缔组织;将组织块在PBS中反复
21、清洗3次后放人分散酶(Dispase)溶液中4过夜消化8 10 h;将过夜消化的组织用PBS清洗后剪碎,加人0.2 5%胰蛋白酶-EDTA消化液使组织块浸没,37 消化10 min,随后加人等量的终止液终止消化;使用孔径0.0 7 4mm的滤网过滤后4、10 0 0 r/min离心8 min;将沉淀用培养基重悬;接种于含有大鼠鼠尾胶原的培养皿中,37,50mL/LCOz培养箱中过夜培养,12 h后观察细胞贴壁情况并适时换液,细胞量达到8 0%90%以上进行传代培养。将细胞传至2 4孔板,进行细胞爬片,待爬片细胞密度达到8 0%以上时,用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min,进行HE染色和免
22、疫荧光鉴定试验,使用倒置荧光显微镜选取多个视野观察并拍照1.6细胞转染RSPO2真核过表达载体和空载体均由南京擎科生物科技有限公司合成;RSPO2干扰载体和空载体均由汉恒生物科技(上海)有限公司设计合成。用质粒小提试剂盒提取质粒。将成纤维细胞接种于六孔板中,当细胞密度达到7 0%左右时进行细胞转染,实验分为过表达组(RSPO2)和空载体组(NC)、干扰组(si-RSPO2)和空载体组(si-NC)。根据Lipofectamin2000说明书进行过表达载体和干扰载体的转染1.7毛囊生长相关基因和增殖相关基因mRNA和蛋白的检测用TRIzol法提取细胞RNA,反转录成cDNA,利用实时荧光定量PC
23、R检测毛囊生长相关基因(-catenin、Le f l、T G F-1 和 BMP4)和增殖相关基因(CCND 1和PCNA)的表达,以18 SrRNA作为内参基因,利用2-MG法分析结果,引物信息见表1。根据RIPA裂解液说明书提取细胞蛋白,进行Western-blot试验检测毛囊生长相关基因(-catenin、Lefl、T G F-1和 BMP4)和增殖相关基因(CCND1和PCNA)的表达,结果用ImageJ1.47软件分析。1.8用CCK-8检测细胞增殖用CCK-8细胞增殖检测法检测培养2 4、48 和72h的转染RSPO2过表达载体和干扰载体后绵羊皮肤成纤维细胞的增殖情况,每孔加10
24、 LCCK-8试剂,在37,50 mL/LCOz细胞培养箱中继续孵育1 h,用酶标仪检测D450mm值。1.9数据分析利用GraphPadPrism8.3分析软件进行相关性分析,*P0.05为差异显著,*P0.01为差异极显著。2丝结果2.1RSPO2在两种绵羊背部皮肤的表达定位免疫组织化学试验结果显示,RSPO2蛋白在美1186第53卷中国兽医科学利奴羊和小尾寒羊背部皮肤中均有表达。在小尾寒羊中,RSPO2主要表达于表皮(图1A-1)、毛基质(图1C-5)、内根鞘(图1C-3)和外根鞘中(图1B-4),在毛乳头(1C-2)和皮脂腺(图1A-6)中可以观察到有微弱的表达;在美利奴羊中,RSPO
25、2主要表达于表皮(图1D-1)、毛基质(1F-5)、内根鞘(1F-3)、外根鞘(图1D-4)、毛乳头(图1E-2)和皮脂腺(图1D-6)中。光密度结果显示,RSPO2蛋白在美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤中的表达量有差异,RSPO2在美利奴羊背部皮肤中的表达量高于小尾寒羊,差异极显著(P0.01,图 2)。00BE图1RSPO2在皮肤组织中的定位表达Figure1 Localized expressionof RSPO2 in sheepskintissueA、B、C、a、b、C:小尾寒羊D、E、F、d、e、f:美利奴羊。AF:阳性;af:阴性。1:表皮;2:毛乳头;3:内根鞘;4:外根鞘;5:毛基
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RSPO2 绵羊 皮肤 中的 差异 表达 毛囊 生长 相关 基因 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。