β-榄香烯对人肺腺癌A549细胞株裸鼠移植瘤放疗增敏作用的研究.pdf
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1、肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumor Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4-榄香烯对人肺腺癌A549细胞株裸鼠移植瘤放疗增敏作用的研究吴文博1,4,胡仲辉1,5,赵庆涛1,牛占丛2,张霄鹏1,张华1,王会恩1,袁征1,段国辰3*(河北省人民医院 1胸外科,2感染性疾病科,河北 石家庄,050051;3河北省儿童医院,河北 石家庄,050030;4河北北方学院,河北 张家口,075000;5河北医科大学,河北 石家庄,050017)摘要:目的建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠移植瘤模型,用增敏剂量的-榄香烯联合放疗对移植瘤进行干预,探讨
2、放疗增敏机制是否与抑制葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)表达有关。方法采用细胞悬液接种法建立裸鼠移植瘤模型,将肿瘤体积达到75 mm3左右的20只裸鼠随机分为空白对照组(NS组)、-榄香烯单药组(ELE组)、-榄香烯联合放疗组(ELE+RAD组)和单纯放疗组(RAD组)。监测干预后各组裸鼠肿瘤体积的变化,获得各组裸鼠的肿瘤生长曲线。通过计算增敏系数,检测 45 mg kg-1-榄香烯是否发挥增敏作用,采用 Real-Time PCR、Western blotting及免疫组化染色检测各组移植瘤中GLUT-1的表达水平。结果成功建立A549细胞株裸鼠移植瘤模型,依据各组移植瘤体积变化绘制生长曲线。
3、测得增敏系数(EF)为2.44,提示-榄香烯的剂量已达到增敏效果。与NS组相比,实验组移植瘤GLUT-1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P0.05);与ELE组、RAD组相比,ELE+RAD组GLUT-1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P0.01)。免疫组化结果显示,与NS组比较,实验组GLUT-1的表达均被显著抑制(P0.05);而ELE+RAD组GLUT-1的表达抑制作用较强(P0.05)。结论增敏剂量的-榄香烯与放疗联合应用可显著抑制裸鼠移植瘤中GLUT-1 mRNA及蛋白表达,明显增强放疗对肺癌裸鼠移植瘤的生长抑制效果,提示-榄香烯可能通过抑制GLUT-1表达发挥放疗增敏作用。
4、关键词:放疗增敏;A549细胞株;-榄香烯;GLUT-1;移植瘤中图分类号:R734.2 文献标识码:A Study on radiosensitivity of-elemene to human lung adenocarcinoma A549 cell line transplanted tumor in nude miceWU Wenbo1,4,HU Zhonghui1,5,ZHAO Qingtao1,NIU Zhancong2,ZHANG Xiaopeng1,ZHANG Hua1,WANG Huien1,YUAN Zheng1,DUAN Guochen3*(1Department of
5、 Thoracic Surgery,2Department of Infectious Diseases,Hebei General Hospital,Shijiazhuang,050051,Hebei,China;3Hebei Childrens Hospital,Shijiazhuang,050030,Hebei,China;4Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China;5Hebei Medical University,Shijiazhuang,050017,Hebei,China)Abstract:Objective To
6、 investigate whether the mechanism of radiosensitization is related to the inhibition of GLUT-1 expression by interfering with the transplanted tumor of human lung adenocarcinoma A549 cell line in nude mice with radiotherapy and sensitized dose of-elemene.Methods The nude mice transplanted tumor mod
7、el was established by cell 基础研究基金项目:河北省医学科学研究重点课题项目(20180151);河北省医学适用技术跟踪项目(G2018008);中医药类科研计划课题项目(2019139)。作者简介:吴文博,男,硕士,住院医师,研究方向:胸部肿瘤学。*通信作者:段国辰,男,博士,教授,博士生导师,研究方向:胸外科疾病手术、综合治疗,肺癌、食管癌研究与治疗。DOI:10.3969/j.issn.2095-1264.2023.04.06文章编号:2095-1264(2023)04-0436-07 436肿瘤药学 2023 年 8 月第 13 卷第 4 期Anti-tumo
8、r Pharmacy,August 2023,Vol.13,No.4suspension inoculation method,and 20 nude mice with a tumor volume of 75 mm3 were randomly divided into the blank control group(NS group),the-elemene single drug group(ELE group),the-elemene combined with radiotherapy group(ELE+RAD group)and the simple radiotherapy
9、group(RAD group).The changes of tumor volume of nude mice after intervention were monitored,and the tumor growth curve of each group of nude mice was obtained.By calculating the radiosensitivity enhancement factor,the sensitivity enhancement effect of selected 45 mgkg-1-elemene was detected,and the
10、expression level and experimental data of GLUT-1 were detected by real-time PCR,Western blotting and immunohistochemical staining.Results The transplanted tumor model of A549 cell line in nude mice was successfully established,and the growth curve was obtained according to the volume changes of each
11、 group.The value of radiosensitivity enhancement factor was 2.44,which suggested that the dose of-elemene has achieved the effect of sensitization in this experiment.Compared with the NS group,the expression of GLUT-1 mRNA and protein decreased significantly in the experimental group(P0.05).However,
12、compared with ELE group and RAD group,the expression levels of GLUT-1 mRNA and protein in ELE+RAD group were greatly decreased(P0.01).Immunohistochemical results showed that the expression of GLUT-1 was significantly inhibited in the experimental group as compared with the NS group(P0.05).However,th
13、e ELE+RAD group had a strong inhibitory effect on the expression of GLUT-1,which was statistically significant as compared with the other groups(P1时,表明具有放射增敏效应4。1.9移植瘤取材观察 16天后处死裸鼠,用无菌手术器械完整剖取瘤体,置于液氮罐中保存,供后续实验使用。1.10RT-PCR 检测 GLUT-1 mRNA 表达取 50 mg移植瘤组织,剪碎后用TRIzol法提取总RNA,取2 L 用紫外分光光度计测定 RNA 浓度,以检测RNA
14、 的完整性。依据 RT-PCR 试剂盒说明书进行RT-PCR扩增,以GAPDH为内参设计引物。GLUT-1:上游 5-TCGGGTGTCTTGTCACTTTGG-3,下游5-TCGGGTGTCTTGTCACTTTGG-3,扩增长度129 bp;GAPDH:上 游 5-ACA ACTTTGGTATCGTGGAAGG-3,下 游 5-GCCATCACGCCACAGTTTC-3,扩增长度101 bp。PCR反应程序:95 15 min,1 个循环预变性;95 10 s,58 30 s,72 30 s,40个循环进行溶解曲线分析。每个样品设 3个复孔,实验重复3次。采用2-Ct法进行结果分析。1.11
15、 Western blotting 检 测 GLUT-1 蛋 白 表 达取 100 mg 移植瘤组织,用 PBS、生理盐水洗涤 23遍,加入适量RIPA裂解液充分裂解,离心取上清,测定蛋白浓度。等量上样,SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜(转膜时间为45 min),小心取出转移膜置于封闭液中,室温、摇床缓慢摇动状态下封闭2 h。一抗(1 1 000)4 反应过夜,PBST洗膜3次,每次10 min;二抗用1PBST稀释3 000倍,将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中作用90 min,PBST洗膜3次,每次10 min,ECL显色,化学发光系统成像。用Tanon GIS软件测量条带灰度值并分
16、析。1.12石蜡切片及IPP分析取新鲜肿瘤标本常规石蜡包埋,4 m 厚连续切片。采用 PV 法进行GLUT-1免疫组织化学染色,染色步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。制作的切片在镜下观察,棕黄色或棕褐色颗粒为阳性蛋白表达。随后采用IPP软件分析系统(Image-Pro Plus 6.0)对蛋白染色结果进行分析处理,选择测量面积,计算累积光密度(integrated optical density,IOD)、平均光密度(average optical density,AOD)。1.13 统 计 学 方 法 采 用 SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0软件对实验数据进行统计学分
17、析。计量资料以均数标准差(x s)表示,多组间比较采用单因素方差分析法,以P0.05)。移植瘤生长速度最快的为NS组。干预后第12天,与NS组比较,ELE组、RAD组及ELE+RAD组对移植瘤的抑制作用均明显增强(P0.05)。干预后第 16 天,与 NS 组比较,ELE组、RAD组及ELE+RAD组对移植瘤的抑制作用均有显著差异(P0.01);且与 RAD 组、ELE 组比较,ELE+RAD 组对移植瘤的抑制作用显著增强(P0.05)(图1、表1)。2.2EFELE+RAD 组 AGD 最长,EF=2.44,提示45 mgkg-1-榄香烯可发挥放疗增敏作用(表2)。2.3-榄香烯放疗增敏作用
18、对移植瘤 GLUT-1 mRNA 表 达 的 影 响 RT-PCR 检 测 结 果 显 示,GLUT-1 mRNA的熔解曲线呈单峰(图2A),提示其荧光定量PCR产物扩增具有特异性。根据GLUT-1 mRNA扩增曲线(图2B),采用2-Ct法分析其相对表达量。与NS组比较,ELE组、RAD组及ELE+RAD组 GLUT-1 mRNA 表达水平均显著降低(P0.01);与 ELE 组、RAD 组 比 较,ELE+RAD 组 GLUT-1 表2增敏系数计算图表Tab.2Calculation chart of enhancement factor组别NS组ELE组RAD组ELE+RAD组初始体积/
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