UPLC-qTOF-MS_MS法测定透骨草中有效成分.pdf
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1、第 53 卷第 11 期2023 年 11 月Vol.53 No.11Nov.20231351 日 用 化 学 工 业(中英文)China Surfactant Detergent&Cosmetics Determination of the active ingredients in Phryma leptostachya L.by UPLC-qTOF-MS/MSPingpingChen1,*,QuanshengXu2,RuiJiang1,SonghaoFeng1(1.Henan Provincial Engineering Research Center of Natural Drug E
2、xtraction and Medical Technology Application,Zhengzhou Railway Vocational&Technical College,Zhengzhou,Henan 450000,China;2.HeNan RunHong Pharmaceutical Co.,Ltd,Zhengzhou,Henan 450000,China)Abstract:An ultra-high performance liquid chromatography(UPLC)coupled with electrospray quadrupole time-of-flig
3、ht mass spectrometry(ESI-qTOF-MS)method was developed for the rapid separation and identification of the components in Phryma leptostachya L.The samples were eluted on an ACQUITY UPLC HSS T3 C18 column(2.1 mm100 mm,1.8 m)with a gradient of 0.1%formic acid(solvent A)and acetonitrile(solvent B)as the
4、mobile phases at a flow rate of 0.25 mL/min.The chromatographic analysis of Phryma leptostachya L.by UPLC-qTOF-MS/MS identifies the characterization of 47 compounds,15 of which are clearly identified by comparison with reference standards.For quantitative analysis,15 major compounds are simultaneous
5、ly detected in 12 batches of Phryma leptostachya L.samples using UPLC-DAD at 210 nm,260 nm and 326 nm.The method is validated in terms of precision,reproducibility,stability and accuracy.In conclusion,this study provides a potential method for the overall quality control of Phryma leptostachya L.Key
6、 words:Phryma leptostachya L.;UPLC-qTOF-MS/MS;quality assessmentReceived:February 28,2023;Revised:October 30,2023.*Corresponding author.Tel.:+86-15515521952,E-mail:.2022年度河南省高等学校重点科研项目(22A360018);2022年河南省医学教育研究项目(Wjlx2022260)DOI:10.3969/j.issn.2097-2806.2023.11.0161352第 53 卷分析与检测日 用 化 学 工 业(中英文)透骨草(
7、Phryma leptostachya L.)是一类世界各地的季节性观赏植物,常常栽培于商店、酒店场所和社会景观中,主要得益它鲜艳的花朵1。传统中医认为,该植物的不同部分可用作治疗疾病和皮肤问 题2。现代研究表明,透骨草的不同提取物和活性成分,包括三萜类皂苷、酚酸和黄酮类化合物,已被报道在体外或体内具有显著的抗氧化作用3,将其添加到护肤品中具有美白、抗衰老、除皱等功效。尽管植物化学已经对透骨草的化学成分进行了深入的研究4,5,但对其化学定量分析仍然是不熟悉的,质量评价也仅限于独立测定26种酚酸6,12种黄酮类7,或25种三萜类8。因此,建立一种定性和定量的分析方法对透骨草进行全面的质量控制非常
8、有必要。超高效液相色谱(UPLC)与DAD联用已成为快速、灵敏、稳定的色谱定量方法之一9。UPLC-TOF-MS/MS系统通过提供准确的前体和/或产物离子信息,质量误差小于5 ppm,启动了更全面的化学分析,这大大增强了成分表征的可靠性10。此外,通过经典的模式识别进行的多元统计分析可以分离出化学组,并快速识别出有区别的成分11。综合使用LC-qTOF-MS/MS定性策略、基于LC-DAD的定量分析和化学计量学已被证实是分析天然产物的有力工具12。本研究中,采用UPLC-DAD进行定量分析,对透骨草中15种成分的含量进行色谱分析和测定,用于化学计量分析和不同样品的鉴别。使用UPLC结合电喷雾电
9、离四极杆飞行时间质谱(ESI-qTOF-MS)进行质量分析。本研究拟提出一种基于UPLC-qTOF-MS/MS导向的特性和基于UPLC-DAD的定量成分数据集的策略,为质量均匀性的多定量评估提供快速的解决方案。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器12个批次透骨草样品于2019年从吉林的商店或市场购买,并由中医药大学教授进行鉴定,风干后的样品被磨成粉末(40目)并保存在干燥器中。乙腈(HPLC级)、甲酸、甲醇、磷酸和超纯水,凯美欧化学试剂有限公司;原儿茶酸(缩写R3,下同)(3,4-二羟基苯甲酸,3,4-Dihydroxybenzoic acid,3,4-DA)、芦丁(R4)(Rutin)、
10、绿原酸(C2)(3-O-咖啡酰奎宁酸,3-O-Caffeoylquinic acid,3-CQA)、咖啡酸(C4)(Caffeic acid,CA)、新绿原酸(C1)(5-咖啡酰奎尼酸,5-Caffeoylquinic acid,5-CQA)、隐绿原酸(C3)(4-咖啡奎宁酸,4-Caffeic quinic acid,4-CQA)、异绿原酸B(C5)(3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸,3,4-Di-O-caffeoylquinic acid,3,4-diCQA、异绿原酸A(C6)(3,5-二咖啡酰奎宁酸,3,5-Dicaffeoylquinic acid,3,5-diCQA),成都普菲德对照品科
11、技有限公司;6-羟基-7,7二氢苯并呋喃-2(6H)-酮(R1)、羟基酪蛋白(R2)、拉蒂弗洛糖苷G(K1)、库迪诺糖苷G(K2)、库迪诺糖苷A(K3)、库迪诺糖苷E(R5)、伊莱库迪诺糖苷T(K4)是从伊莱库丁查中分离得到,并通过化学和光谱方法对其结构进行了表征。经测试,这些参考物质的纯度都在98%以上。5600+四极杆飞行时间质谱仪,美国AB SCIEX公司;LC-30A超高效液相色谱系统,日本岛津公司。UPLC-qTOF-MS/MS法测定透骨草中有效成分陈萍萍 1,*,许全升 2,姜 锐 1,冯松浩 1(1.郑州铁路职业技术学院 河南省天然药物提取和医疗技术应用工程研究中心,河南 郑州
12、450000;2.河南润弘制药股份有限公司,河南 郑州 450000)摘要:建立了超高效液相色谱(UPLC)与电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-qTOF-MS)相结合的方法用于快速分离和鉴定透骨草中的成分。样品在ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)上以0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈(溶剂B)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.25 mL/min。通过UPLC-qTOF-MS/MS对透骨草进行色谱分析,确定了47个化合物的特征,其中15个化合物通过与参考标准的比较得到了明确的鉴定。为了进行定量分析,使用UPLC-DAD在210,260和326 n
13、m的波长下同时检测了来自12个批次透骨草样品的15种主要化合物。该方法在精密度、重复性、稳定性、准确度等方面进行了验证。本研究为透骨草的整体质量控制提供了潜在的方法。关键词:透骨草;UPLC-qTOF-MS/MS;质量评估中图分类号:TQ658 文献标识码:A 文章编号:2097-2806(2023)11-1351-101353第 11 期分析与检测陈萍萍,等:UPLC-qTOF-MS/MS法测定透骨草中有效成分 1.2 UPLC-qTOF-MS/MS定性分析色谱分离在ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)上实现,以0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈
14、(溶剂B)为流动相,采用梯度洗脱,01 min,6%B相;17 min,6%25%B相;710 min,25%B相;1011 min,25%32%B相;1118 min,32%52%B相;1822 min,52%90%B相。色谱条件经过优化,在25 min内获得良好的分离效果。流速设定为0.25 mL/min,温度保持在30。每次运行之间的再平衡时间设定为3 min。注入1 L样品后,将柱子的流出物直接引入加热的电喷雾(ESI)源,在负离子模式下进行分析。ESI源参数:离子喷雾电压浮动(ISVF),-4.5 kV;涡轮喷雾温度(TEM),550;雾化器气体(气体1),55 psi;加热器气体(
15、气体2),55 psi;碰撞能量(CE),MS1为-5.0 eV,MS2为-45 eV;解聚电压(DP),-180 eV。质谱以全扫描质谱模式记录,从m/z 100 2 000,在进行外部质量校准后有250 ms的离子积累时间,数据采集由MultiQuant 3.0软件(AB SCIEX,USA)控制。全程扫描时采用动态背景减法(DBS)和信息依赖性采集(IDA),用于触发低浓度成分的MS/MS分析的采集。对于IDA标准,每个分析物中超过100 cps的8个最强烈的碎片离子被选作生产扫描。此外,一个自动校准传递系统(CDS)可以每3 h自动调节一次MS和MS/MS。1.3 UPLC-DAD定量
16、分析定量分析在ACQUITY UPLC H级系统(Waters,美国)上进行,使用ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)。流动相由0.05%的磷酸水溶液(A)和乙腈(B)组成,采用梯度洗脱方式。检测波长设置为210,260和326 nm,用于记录不同成分的最大吸收值。其他色谱条件如梯度程序、流速、柱温和进样量与1.2节所述相同。1.4 样品溶液的制备将约0.2 g磨碎的透骨草样品粉末(40目)准确称量在棕色塞子烧瓶中,准确加入20.0 mL甲醇并称重,在室温(253)下浸泡30 min后,在冰浴中使用超声波进行萃取10 min。待提取液冷却后再
17、次称重,用甲醇补充损失的溶剂并充分混合。提取液在注射前通过0.22 m的滤膜过滤。1.5 标准溶液的制备准确称取R1、R2、R3、C1、C2、C3、C4、R4、C5、C6、K1、K2、K3、R5、K4 15种参考物质适量,溶于甲醇,制备参考标准测试溶液。15种参考化合物的混合储备溶液质量浓度分别为62.0,380,10.13,101.7,755,101.0,106.0,31.6,106.6,1 365,1 045,915,1 065,60.0和39.0 g/mL,然后分别稀释到校准曲线的适当质量浓度范围。所有测试溶液在分析前均储存在4。1.6 数据处理200多个化合物的信息,包括琐碎的名称、分
18、子式和分子量被添加到Peak View Software TM V.1.1(AB SCIEX,Foster City,CA)。Peak View软件的“匹配”功能将符合确定的分子式的化合物确定为潜在的候选化合物。这15个峰通过与标准或文献报道的保留时间和碎片模式的比较得到确定。计算15个成分峰的相对保留时间(tR)与相应的参考峰(R4(max=260 nm),C6(max=326 nm)和K3(max=210 nm)的关系。2 结果与分析2.1 萃取程序的优化根据文献,用甲醇水溶液进行超声处理是首选的提取方法13。为了优化其他变量对该程序中涉及的15种成分提取效率的影响,采用了不同的固液比(3
19、0倍,50倍和100倍)、提取时间(15,30,45和60 min)和提取次数(一次、两次和三次)的单变量测试。萃取效率是通过比较每一类成分的总含量来评估的,最有效的萃取被认为是萃取了这些成分的最高含量。对于单因素实验,选择100倍的甲醇溶剂量和一次提取频率作为评估提取时间(因素1)的影响的程序。按照这种方式,依次研究了溶剂倍数和提取频率。一个完整的提取实验算作一次运行,总共有30次萃取实验。根据萃取效果,最终确定提取程序为在冰浴下使用100倍的甲醇进行30 min的超声处理。2.2 UPLC-DAD和UPLC-qTOF-MS条件的 优化考察了洗脱程序、洗脱溶剂系统(水-乙腈和水-甲醇)以及水
20、相中磷酸的含量(0.02%,0.05%和0.1%)。从线性梯度洗脱的结果来看,水(含0.05%磷酸)和乙腈显示出最好的分离率。与甲醇相比,乙腈显示出更好的分离效率,减少了背景噪音,基线漂移1354第 53 卷分析与检测日 用 化 学 工 业(中英文)也较轻,符合预期。此外,磷酸的加入对减少有机酸的峰尾有很大的影响,而且它没有紫外线吸收,适合梯度洗脱和检测波长接近末端吸收的成分分析。考察了不同的色谱柱,包括Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)和YMC-Triart UPLC C18柱(2.0 mm100 mm,1.9 m)。比较了
21、不同的柱温(25,30和35)和流动相的流速(0.2,0.25和0.3 mL/min)。最终选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)、30 柱温和0.25 mL/min流速的色谱条件可达到较佳的分离效果。根据被分析物的最大吸收值,检测波长被设定为260,326和210 nm。研究了不同的质谱参数,如检测模式、碰撞能量和解聚电位(DP)。由于化合物结构不同,对正、负电离模式进行考察后,结果显示,在负离子ESI谱中比在正离子ESI谱中获得更多的活性成分信息。通过比较代表性的酚酸和三萜类皂苷与DP值(范围从-60 eV到-200
22、eV)的质量响应,发现大多数三萜类皂苷的信号丰度随着DP值的增加而提高,而大多数酚酸则呈现出相反的趋势。因此,选择DP值为-60 eV和-180 eV的MS条件来独立收集TIC色谱图。增加MS2的CE会提高三萜类皂苷的信号丰度,所以MS2的CE被设定为-45 eV。其他质谱条件参数,包括离子喷雾电压浮动(ISVF)、涡轮喷雾温度(TEM)、雾化器气体(气体1)、加热器气体(气体2)、帘幕气体(CUR)以及MS1的CE都是根据一般的推荐值规则采用的。2.3 透骨草化学成分的鉴定首先,用标准品对目标化合物的断裂规律和特征碎片进行归纳;接着,用UPLC-qTOP-MS/MS研究了15种化合物,包括皂
23、苷、酚酸和黄酮类化合物。在全扫描质谱中,大多数的真品化合物呈现出M-H -负模式。由于流动相中存在甲酸,大多数皂甙都出现了M+HCOO -的离子。采用多种方法,包括数据库检索、参考标准比较、qTOF-MS和MS/MS数据分析,对透骨草的成分进行了结构性鉴定。根据高精度的 M-H -/M+HCOO -(负离子模式)前体离子,推断出未知结构的化学式。与所确定的化学式相匹配的、被认为经历了观察到的MS/MS碎片的化合物被选为最终身份。在56个标记峰中(图1),共有47个化合物,包括16个酚酸类,28个萜类和3个黄酮类被鉴定或部分定性。在这些成分中,有15个化合物通过与参考标准的tR和MS/MS产物片
24、段的比较得到了明确的鉴定。有关特征成分的信息,如tR(min),分子式,观察到的m/z值,质量误差(ppm),以及MS2产物碎片离子的信息汇总归纳在表1中。表1 负离子模式下的UPLC-qTOF-MS/MS鉴定透骨草的化学成分Tab.1 Identification of the chemical composition of Phryma leptostachya L.by UPLC-qTOF-MS/MS in negative ion mode编号tR/minM.F.M.W./Da质量误差/ppmMS/MS碎片(m/z)鉴定 11.036C21H30O11458.178 8503.176
25、5 M+HCOO -/(-1.0)503:221,191,179,161,89油菜花苷A*(Oleuropein A*)23.616C8H8O3152.047 3197.045 1 M+HCOO -/(2.5)197:1636-羟基-7,7a-二氢苯并呋喃-2(6)H-酮(R1)(6-Hydroxy-7,7-dihydrobenzofuran-2(6)H-one)33.810C14H20O8316.115 8361.113 6 M+HCOO -/(1.9)361:343,315,297,269,253,217,201,175,161,135,131,101,71羟基酪蛋白(R2)(Hydrox
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