![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用.pdf
《Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用.pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)浙 江 大 学 学 报(医 学 版)2023 年 10 月October 2023Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用代晓阳1,刘湘宁1,葛孚晶1,朱宏道1,郑楚润1,严芳洁2,杨波11.浙江大学药学院,浙江 杭州 3100582.浙江大学智能创新药物研究院,浙江 杭州 310018摘 要 目的:研究Polo样激酶1(PLK1)抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中的作用及其合用奥希替尼的抗肿瘤效果。方法:利用药物浓度递增法构建对奥希替尼耐药的NCI-H19
2、75细胞模型;在耐药细胞上合用肿瘤经典通路抑制剂库化合物与奥希替尼,筛选与奥希替尼存在协同作用的化合物;利用基因集富集分析考察奥希替尼耐药通路;利用磺酰罗丹明B染色法考察PLK1抑制剂对奥希替尼耐药细胞的抑制作用及其合用奥希替尼的抗肿瘤作用。结果:成功建立奥希替尼耐药细胞模型(耐药指数=43.45)。PLK1抑制剂GSK 461364和BI 2536与奥希替尼存在协同作用,与敏感细胞比较,奥希替尼耐药细胞中PLK1调控通路和细胞周期通路显著激活,且在接受奥希替尼治疗的表皮生长因子受体突变 NSCLC患者队列中,PLK1信使 RNA水平与患者的无进展生存期呈负相关(R=0.62,P0.05),证
3、实NSCLC细胞中PLK1过度激活可能导致细胞对奥希替尼耐药。进一步体外实验发现,PLK1抑制剂伏拉塞替和GSK 461364对奥希替尼耐药细胞的半抑制浓度小于敏感细胞,相较于单用奥希替尼,PLK1抑制剂与奥希替尼合用可显著增强对耐药细胞的增殖抑制作用。结论:PLK1抑制剂与奥希替尼合用对奥希替尼耐药的NSCLC细胞的抑制作用更强,有可能用于奥希替尼耐药患者的干预和治疗。关键词 非小细胞肺癌;NCI-H1975细胞;奥希替尼;耐药性;Polo样激酶抑制剂;联合用药;生物信息学中图分类号 R734.2 文献标志码 AThe effect of PLK1 inhibitor in osimerti
4、nib resistant non-DOI:10.3724/zdxbyxb-2023-0305收稿日期(Received):2023-06-30 接受日期(Accepted):2023-09-23 网络预发表日期(Online):2023-10-19基金项目(Funding):国家自然科学基金(82104193);浙江省自然科学基金(LY22H310001)第一作者(First author):代晓阳,实验师,主要从事药理毒理学研究及新药研发;E-mail:;https:/orcid.org/0000-0003-4469-4502.刘湘宁,硕士研究生,主要从事分子肿瘤药理学研究;E-mail:
5、;https:/orcid.org/0009-0007-2624-888X通信作者(Corresponding author):严芳洁,副研究员,主要从事创新药物研发;E-mail:;https:/orcid.org/0009-0003-7836-1527.杨 波,教授,博士生导师,主要从事分子肿瘤药理学研究及新药研发;E-mail:;https:/orcid.org/0000-0002-6505-2771 专题报道 肿瘤靶向治疗Open Access代晓阳,等.Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用small cell lung carcinoma cellsDAI
6、Xiaoyang1,LIU Xiangning1,GE Fujing1,ZHU Hongdao1,ZHENG Churun1,YAN Fangjie2,YANG Bo1(1.College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Innovation Institute for Artificial Intelligence in Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310018,China)DAI Xiaoyang and LIU Xiangning
7、contributed equally to this work.Corresponding authors:YAN Fangjie,E-mail:,https:/orcid.org/0009-0003-7836-1527;YANG Bo,E-mail:,https:/orcid.org/0000-0002-6505-2771Abstract Objective:To investigate the effects of PLK1 inhibitors on osimertinib-resistant non-small cell lung carcinoma(NSCLC)cells and
8、the anti-tumor effect combined with osimertinib.Methods:An osimertinib resistant NCI-H1975 cell line was induced by exposure to gradually increasing drug concentrations.Osimertinib-resistant cells were co-treated with compounds from classical tumor pathway inhibitor library and osimertinib to screen
9、 for compounds with synergistic effects with osimertinib.The Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)was used to investigate the activated signaling pathways in osimertinib-resistant cells;sulforhodamine B(SRB)staining was used to investigate the effect of PLK1 inhibitors on osimertinib-resistant cells an
10、d the synergistic effect of PLK1 inhibitors combined with osimertinib.Results:Osimertinib-resistance in NCI-H1975 cell(resistance index=43.45)was successfully established.The PLK1 inhibitors GSK 461364 and BI 2536 had synergistic effect with osimertinib.Compared with osimertinib-sensitive cells,PLK1
11、 regulatory pathway and cell cycle pathway were significantly activated in osimertinib-resistant cells.In NSCLC patients with epidermal growth factor receptor mutations treated with osimertinib,PLK1 mRNA levels were negatively correlated with progression free survival of patients(R=0.62,P0.05),indic
12、ating that excessive activation of PLK1 in NSCLC cells may cause cell resistant to osimertinib.Further in vitro experiments showed that IC50 of PLK1 inhibitors BI 6727 and GSK 461364 in osimertinib-resistant cells were lower than those in sensitive ones.Compared with the mono treatment of osimertini
13、b,PLK1 inhibitors combined with osimertinib behaved significantly stronger effect on the proliferation of osimertinib-resistant cells.Conclusion:PLK1 inhibitors have a synergistic effect with osimertinib on osimertinib-resistant NSCLC cells which indicates that they may have potential clinical value
14、 in the treatment of NSCLC patients with osimertinib resistance.Key words Non-small cell lung carcinoma;NCI-H1975 cells;Osimertinib;Drug resistance;Polo-like kinase1 inhibitors;Drug combination;BioinformaticsJ Zhejiang Univ(Med Sci),2023,52(5):558-566.缩略语 非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC);
15、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR);EGFR 激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI);Polo 样激酶(Polo-like kinase,PLK);磺酰罗丹明 B(sulforhodamine B,SRB);半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);559浙江大学学报(医学版)Journal of Zhejiang University(Medical Sciences)差异倍数(fold change,FC);糖原合酶激
16、酶(glycogen synthase kinase,GSK);细胞间充质-上皮转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET);转染过程中重排(rearranged during transfection,RET);丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK);腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)NSCLC包括肺腺癌和鳞状细胞癌,占肺癌的80%85%,是全球癌症相关死亡的主要原
17、因之一1。约50%的亚洲NSCLC患者中检测到EGFR激活突变2,这些患者采用 EGFR-TKI治疗后存活率及临床结局显著改善3。作为第三代EGFR-TKI,奥希替尼对 EGFR 敏感性激活突变以及T790M耐药突变细胞的抑制率更高4,是EGFR-T790M突变所致耐药的NSCLC患者的一线治疗药物5。然而,尽管治疗初期患者对奥希替尼的响应率良好,但仍不可避免会出现获得性耐药6。因此,探寻奥希替尼的耐药机制、开发奥希替尼耐药的治疗策略对NSCLC患者的临床治疗具有重要意义。PLK1属于丝/苏氨酸蛋白激酶的Polo亚家族,在人体具有有丝分裂活性的细胞和组织中高表达,参与调控细胞周期进展、分化和存
18、活等多种细胞过程7。PLK1在多种人类恶性肿瘤中高表达并与患者的不良预后相关8,有研究报道PLK1驱动NSCLC细胞的上皮-间充质转化从而促进NSCLC转移9。近年来,研究者开发出多款PLK1小分子抑制剂,这些小分子抑制剂在肿瘤临床前治疗研究中展现出良好的活性,但因为剂量限制性毒副作用及脱靶效应在临床试验中表现欠佳10。本研究在成功构建奥希替尼耐药的 NSCLC细胞株基础上,筛选出对奥希替尼耐药细胞有抑制作用的PLK1抑制剂,并考察了PLK1抑制剂与奥希替尼的协同治疗效果,旨在为NSCLC的奥希替尼耐药问题提供新的解决方案。1材料与方法1.1主要试剂和仪器人NSCLC细胞株NCI-H1975购
19、自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;NCI-H1975敏感株与耐药株源自 GSE146850 队列(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE146850),PC-9敏 感 株 与 PC-9 耐 药 株 源 自 GSE153183 队 列(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE153183)。肿瘤经典通路抑制剂化合物库(L3500)为美国 Selleck 公司产品;奥希替尼、PLK1抑制剂为美国MedChemExpress公司产品;RPMI-1640 培 养
20、基、胎 牛 血 清 为 美 国 Thermo Fisher公司产品;胰蛋白酶为美国Invitrogen 公司产品;Tris-base为德国BioFroxx公司产品;SRB为美国Sigma-Aldrich公司产品。细胞培养箱与生物安全柜为美国 Thermo Electron公司产品;普通倒置显微镜为日本Leica公司产品;多功能酶标仪为美国 Thermo Fisher Scientific公司产品。1.2细胞培养NCI-H1975 细胞在添加了 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养,所有细胞均置于培养箱(37、5%二氧化碳)中,
21、待细胞生长至合适密度时进行传代培养,经0.05%胰蛋白酶消化传代,所有实验细胞均传代不超过十次。1.3药物浓度递增法构建耐药株取汇合度60%80%的人NSCLC细胞株NCI-H1975(即药物敏感细胞株,记为 H1975 敏感细胞),在培养基加入 1 nmol/L 的奥希替尼,培养24 h 后观察细胞状态。若细胞大量死亡则弃含药培养基并用磷酸盐缓冲液清洗,更换不含药物培养基继续培养,待细胞生长速度至对数生长期,消化传代后再次加入1 nmol/L奥希替尼培养24 h,及时观察细胞状态,若细胞仍大量死亡则继续做撤药处理,待细胞增殖至正常状态后,重复上述循环,直至当细胞在1 nmol/L 奥希替尼培
22、养条件下稳定增殖并连续传代三次以上。按20 nmol/L的药物浓度差提升奥希替尼浓度,继续培养24 h。若细胞增殖速度异常缓慢或大量死亡,则更换为原含1 nmol/L奥希替尼的培养基,待其恢复至正常增殖速度后再次更换为筛选浓度培养基。重复上述循环,直至细胞在该筛选药物浓度培养条件下稳定增殖并连续传代三次以上。期间需在不同时间段测量细胞对于奥希替尼的IC50560代晓阳,等.Polo样激酶1抑制剂在奥希替尼耐药的非小细胞肺癌细胞中的作用以确定耐药指数,耐药指数=耐药细胞 IC50/亲本细胞IC50。耐药株构建时间共计7个月,最终细胞维持培养浓度为1 mol/L,耐药株记为H1975耐药细胞。1.
23、4肿瘤经典通路抑制剂库筛选与奥希替尼具有协同作用的化合物将 肿 瘤 经 典 通 路 抑 制 剂 库 中 化 合 物(0.1 mol/L)与奥希替尼(0.5 mol/L)联合用于H1975耐药株中,使用SRB染色检测并计算细胞株的增殖抑制率,以单用奥希替尼(0.5 mol/L)的细胞株增殖抑制率为对照,筛选出肿瘤经典通路抑制剂库中与奥希替尼存在协同作用的化合物。1.5SRB染色法考察细胞存活率H1975 敏感细胞和 H1975 耐药细胞分别以3.0104个/孔 的 细 胞 密 度 接 种 于 96 孔 板 中(100 L/孔),于细胞培养箱中培养24 h后,给予梯度浓度的相应化合物孵育 72 h
24、。孵育结束弃去上清液,每孔加入 100 L 10%三氯乙酸溶液固定,弃培养液,用双蒸水洗涤后烘干。每孔加入 100 L SRB 染色液(用 1%冰醋酸配置,每500 mL 加 入 1.52.0 g SRB 粉 末),室 温 放 置20 min,用1%冰醋酸洗涤干净后烘干。每孔加入100 L Tris-base 碱溶液溶解结合到细胞内的SRB染色液,置于室温摇床20 min后,检测515 nm波长处的吸光度值并计算细胞存活率。1.6差异基因富集分析考察耐药株中 PLK1信号通路的变化情况选取 GSE146850 队列中 H1975 奥希替尼耐药株与敏感株以及GSE153183队列中PC-9耐药株
25、与敏感株的转录组数据,使用R软件包limma 3.42.2对数据进行比较并计算差异基因,筛选差异基因标准为 P0.05 且log2FC的绝对值大于1。对分析得到的差异基因采用R软件包clusterProfiler 4.0进行基因集富集分析,评估差异基因中相关信号通路的富集情况。1.7采用NSCLC患者队列数据分析PLK1表达水平与患者无进展生存期的相关性选取11例接受过奥希替尼治疗后的EGFR突变的NSCLC患者的RNA测序数据与生存随访数据(https:/ mRNA表达水平与患者无进展生存期的相关性。1.8统计学方法采 用 RStudio(R 软 件 包 ggplot2)、Excel 和Gr
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- Polo 激酶 抑制剂 奥希替尼 耐药 细胞 肺癌 中的 作用
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。